توزيع المياه Xylem في النباتات الخشبية تصور مع مجهر إلكترون المسح بالتبريد

إن توافر الموارد المائية (أي التهطال ومحتوى مياه التربة) يحدد بدقة معدل الوفيات والتوزيع الجغرافي لأنواع النباتات، حيث أنها تحتاج إلى امتصاص المياه من التربة ونقلها إلى أوراق إنتاج التمثيل الضوئي. يجب على النباتات الحفاظ على شبكة النقل المائي الخاصة بها تحت إمدادات المياه المتقلبة. وعلى وجه الخصوص، تولد النباتات الخشبية توترات عالية في قنواتها على طول مجاري الناحيات، حيث أنها تحتاج في بعض الحالات إلى الاحتفاظ بتاجها على ارتفاع يزيد عن 100 متر فوق سطح الأرض. للحفاظ على أعمدة المياه تحت هذا الضغط السلبي العالي، قنوات xylem تتكون من سلسلة متصلة من الخلايا الأنبوبية مع جدران الخلايا الصلبة ومحصنة المسعورة¹. إن ضعف الضعف في ضعف القناة إكسيليم لقنوات إكسيليم في كل نوع هو عامل محدد جيد لبقاء الأنواع تحت إمدادات المياه المتقلبة². وبالإضافة إلى ذلك، فإن دراسة حالة المياه من قنوات xylem مهم لتقييم الحالة الصحية للأشجار الفردية التي تتعرض لضغوط لاأحيائية أو حيوية. قياس تدفق النسغ أو إمكانية المياه يمكن أن توفر تقديرات لحالة المياه مصنع خشبي بسبب وظيفة هيدروليكية متكاملة من قنوات xylem. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يؤدي تصور توزيع المياه في خلايا إكسيليم إلى توضيح حالة المكونات الفردية للنظام الهيدروليكي إكسيليم.

توجد عدة تقنيات لتصور حالة المياه من قنوات xylem³. الأساليب الكلاسيكية والمفيدة لمراقبة مسارات المياه في الأنسجة الخشبية تنطوي على تلطيخ عمود الماء عن طريق غمر نهايات قطع الفروع في صبغ أو عن طريق حقن صبغة في شجرة دائمة ينبع⁴. كما يسمح التصوير بالأشعة السينية اللينة بتصور توزيع المياه لشرائح الأقراص الخشبية بسبب شدة امتصاص الأشعة السينية التفاضلية للرطوبة في زيليم⁵و6. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا توفر سوى مسارات لحركة المياه أو تبين توزيعات للمياه. في الآونة الأخيرة، تقنيات المراقبة غير المدمرة، مثل التركيز الدقيق بالأشعة السينية التصوير المقطعي (μCT)^7و8و9و¹⁰والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)^{11، 12}, وقد تحسنت بشكل كبير للسماح لمراقبة المياه في قنوات xylem داخل الشتلات سليمة. هذه الأساليب غير المدمرة لها مزايا كبيرة في أننا يمكن أن نلاحظ حالة المياه xylem دون آثار قطع الاصطناعية، ويمكننا تتبع ديناميات تدفق المياه عن طريق التصوير متتابعة أو إدخال عامل التباين^10. ومع ذلك، نحن بحاجة إلى استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مخصصة للتصوير النباتي أو منشأة متخصصة لميكروكت القائم على سينكروترون من أجل الحصول على الصور التي يمكن تحديد محتوى المياه على مستوى الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن نظام ميكروكت القائم على سينكروترون تمكين للحصول على صور دقيقة مع دقة عالية المكانية، والتي هي مماثلة للميكروسكوب الضوئي^7،8،9، يمكن أن يصاب الخلايا الحية من قبل إشعاع من الطاقة العالية الأشعة السينية^13،14. استخدام المجهر الإلكتروني المسح التي يتم فيها تثبيت وحدات التبريد (cryo-SEM) هو طريقة مفيدة جدا لتحديد بدقة المياه في إكسيليم على المستوى الخلوي، على الرغم من أن هذا يتطلب حصاد المدمرة العينة للمراقبة. لإصلاح المياه في قنوات xylem، يتم تجميد جزء من ينبع (أي الأغصان، فروع أو ينبع) في الموقععن طريق النيتروجين السائل (LN 2). ملاحظات سطح العينات المقصوصة والمجمدة من قبل cryo-SEM توفر صوراً مكبرة للغاية لهيكل إكسيليم الذي يمكننا من خلاله تحديد المياه في قنوات إكسيليم كجليد. ومن القيود الهامة على هذه الطريقة أن المراقبة المتتابعة لقابلية نقل المياه داخل نفس العينة مستحيلة. ومع ذلك، فإن تطبيق التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير بالرنين المغناطيسي للمراقبة المتتابعة للأشجار التي تعيش في حقل ما يشكل تحدياً كبيراً لأن هذه الأدوات ليست محمولة. وعلى النقيض من ذلك، فإن cryo-SEM لديه القدرة على استخدام هذه التقنية على الأشجار الكبيرة في التجارب الميدانية لتصور محتويات المياه بوضوح ليس فقط على المستوى الخلوي ولكن أيضا على مستوى بنية أدق، مثل المياه في الحفر بين الأوعية الدموية^15،والمياه في المساحات بين الخلايا¹⁶، أو فقاعات في عمود المياه^17.

وقد تم الإبلاغ عن العديد من الدراسات مراقبة المياه إكسيليم بواسطة CRYO-SEM ^{5،12،18،19،20،21،23}. وقد أنشأ أوتسومي وآخرون (1996) في البداية بروتوكول اعادة النظر في حالة الزلمة في الموقع عن طريق تجميد تثبيت جذع حي عن طريق ملء LN₂ في حاوية توضع على الجذع²¹. وحافظت درجة حرارة العينة على أقل من -20 درجة مئوية أثناء جمع العينات وأثناء تحضير الكريو -SEM من أجل تجنب ذوبان الجليد داخل قنوات إكسيليم. وقد استخدمت هذه الطريقة لمراقبة المياه في إكسيليم من أجل توضيح توزيع المياه في ظل تغيير نظام المياه^{11,12,24,25,26, 27,28}, التغير الموسمي لتوزيع المياه^21,29,30, تأثير دورات التجميد الذوبان^{17,31, 32}, توزيع المياه في الخشب الرطب⁵, التغيرات في توزيع المياه خلال الانتقال من خشب السابود إلى خشب القلب²⁰, الموسمية دورة من النشاط الكامبيال وتمايز السفن³³, والتجويف الناجم عن بعض الضغوط الحيوية^23،34. كما تم التحقق من التوصيل الهيدروليكي والقنوات الضعف إلى التجويف باستخدام CRYO-SEM^35،36. وقد استخدم نظام Cryo-SEM المجهز بمطياف الأشعة السينية المشتت للطاقة (EDX أو EDS) لدراسة توزيع العناصر على سطح عينة تحتوي على الماء³⁷.

تجميد تثبيت الجذع الحية التي تحتوي على قنوات تحت التوتر الهيدروليكي العالي يسبب أحيانا التجويف الاصطناعي التي لوحظت من قبل CRYO-SEM كما كسر بلورات الجليد في تجويف من القنوات^38،39. وعلى وجه الخصوص، فإن الأنواع ذات الأوراق العريضة ذات القنوات الأطول والأوسع معرضة للقطع الأثرية الناجمة عنالتوتر، مثل التجويف الناجم عن قطع العينات، حتى لو أجريت تحت الماء 3،^40. التجويف القطع الأثرية تصبح واضحة بعد أخذ العينات من شجرة تُحدث (أي أخذ العينات خلال النهار) أو في ظل ظروف الجفاف الشديد ويمكن أن تضلل إلى المبالغة في تقدير حدوث التجويف^{3,38, 39}. ولذلك، فإن التوتر العمل في القنوات يجب أن يطلق سراحه منأجل تجنب التجويف artifactual 3،^12،39.

وغالبا ما تستخدم تقنية تجميد الكسر باستخدام سكين مثبت في غرفة عينة لفضح سطح العينة للمراقبة cryo-SEM. ومع ذلك، تجميد كسر الطائرات من الأنسجة النباتية الخشبية، وخاصة المقاطع المستعرضة من xylem الثانوية، هي خشنة جدا لمراقبة بوضوح المعالم التشريحية والمياه في الأنسجة⁶. تطبيق كريوستات لتقليم عينة يسمح إعداد سريع وعالي الجودة من السطوح عينة^20،23. والهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم الأدلة مع دقة المجهر الإلكتروني لتوزيع المياه في أنواع مختلفة من خلايا إكسيليم في الموقع دون حدوث القطع الأثرية أخذ العينات. نحن نقدم لدينا إجراء تحديث، والتي تم تحسينها بشكل مطرد منذ اعتمدنا لأول مرة، فيما يتعلق بأخذ العينات، وتقليم وتنظيف سطح العينة للحصول على ميكروغرافات الإلكترون عالية الجودة من عينات cryo ثابت من xylem.