Summary

הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

Published: June 21, 2019
doi:

Summary

כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג’ל אלקטרופורזה (PAGE) ג’לים. לאחר הפעלת ג’לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.

Abstract

באופן שגרתי ובאמצעות ג’ל פוליאקרילמיד משמשים לאפיון מורכבות של ריבונאופלפרוטאין (RNP) ולמדידת גודל RNA, בהתאמה. כמו שיטות רבות של הדמיה ג’ל להשתמש כתמים לא ספציפיים או בדיקה fluorophore יקר, רגיש, להפלות, ומתודולוגיות הדמיה חסכונית-ג’ל הם רצויים מאוד. RNA רצפי הליבה של מנגו הם קטנים (19-22 nt) רצף מוטיבים כי, כאשר נסגר על ידי גזע שרירותי RNA, יכול להיות פשוט ובזול מצורף ל-RNA של עניין. אלה תגי מנגו לאגד עם אהדה גבוהה וספציפיות thiazole-כתום fluorophore ליגיום הנקרא TO1-Biotin, אשר הופך אלפי פעמים פלורסנט יותר על הכריכה. כאן אנו מראים כי מנגו I, II, III, ו IV יכול לשמש במיוחד בתמונה RNA ב ג’לים עם רגישות גבוהה. קצת כמו 62.5 fmol של RNA ב ג’לים מקומיים ו 125 fmol של RNA בג הרפתקאות ניתן להבחין על ידי ג’ל הטבילה במאגר דימות המכיל אשלגן ו 20 ננומטר TO1-Biotin עבור 30 דקות. אנו להדגים את הספציפיות של מנגו מערכת מתויגים על ידי דימות מנגו-שתייגת ה-RNA בקטריאלי של 6S בהקשר של תערובת מורכבת של רנ א חיידקי הכולל.

Introduction

מנגו הוא מערכת תיוג RNA המורכב מסדרה של ארבעה RNA פלורסנט קטנים aptamers לאגד בחוזקה (כריכת nanomolar) כדי נגזרות פשוטות של thiazole-כתום (TO1-Biotin, איור 1A)1,2,3 . עם הכריכה, הקרינה הפלואורסצנטית של זה הוא גדל 1,000-to 4,000-לקפל בהתאם לאפאלף המסוים. בהירות גבוהה של מערכת מנגו, אשר עבור מנגו III עולה על זה של חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP), בשילוב עם הזיקה של האיגוד nanomolar של ה-RNA מנגו aptamers, מאפשר לו לשמש הן הדמיה וטיהור של RNA תסביכים2,4.

רנטגן מבנים של מנגו אני5, השני6, ו III7 היו נחושים ברזולוציה גבוהה, וכל שלושת Aptamers לנצל את ה-RNA 4 מ א כדי לאגד TO1-biotin (איור 1b– D). הליבות הקומפקטיות של כל שלושת האפתמים מבודדים מרצף ה-RNA החיצוני באמצעות מוטיבים מתאם קומפקטיים. מנגו I ו-II לנצל מתאם גמישה GNRA כמו לולאה כדי לחבר את ליבות מנגו שלהם לדופלקס RNA שרירותי (איור 1B, C). לעומת זאת, מנגו השלישי משתמש מוטיב טריפלקס נוקשה לחבר את הליבה שלה סליל RNA שרירותי (איור 1D, שאריות סגולים), בעוד המבנה של מנגו IV אינו ידוע כעת. כמו הליבה ליגולי מחייב של כל אחד מהאפתמים האלה מופרד מרצף ה-RNA החיצוני על ידי המתאמים הללו, נראה כי הם יכולים להיות פשוט שולבו מגוון של RNAs. ה-rna התלת-ממדי של החיידק (מנגו i), הרכיבים של השמרים מלצונים (מנגו i), ו-rna 5s, U6 rna, ו-C/D scarna (מנגו II ו IV) כל היתה בהצלחה מתויג באופנה2,8, הרומז כי רבים RNAs ביולוגי יכול להיות מתויג באמצעות RNA מנגו מערכת aptamer.

הרפתקאות מקורי וג משמשים בדרך כלל כדי ללמוד RNAs. ג’לים משומשים משמשים לעתים קרובות כדי לשפוט את הגודל או העיבוד של RNA, אבל בדרך כלל, במקרה של כתם בצפון, למשל, דורשים מספר שלבים איטיים ורציפים כדי ליצור תמונה. בעוד כאשר ה-RNA fluorogenic אחרים, כמו תרד RNA וברוקולי, כבר נעשה שימוש בהצלחה עבור הדמיה ג’ל9, אין מערכת apers fluorogenic עד היום בעל בהירות גבוהה ואהדה של מערכת מנגו, מה שהופך אותו עניין רב לחקור יכולות הדמיה ג’ל של מנגו. במחקר זה, תהינו אם מערכת ה-RNA מנגו יכול להיות פשוט מורחב ג’ל הדמיה, כמו עירור אורכי גל פליטה של TO1-Biotin (510 nm ו 535 nm, בהתאמה) מתאימים הדמיה בערוץ eGFP משותף הפלורסנט ביותר מכשור סריקת ג’ל.

הפרוטוקול שלאחר ג’ל מכתים הציג כאן מספק דרך מהירה במיוחד לזהות מנגו מתויגות מולקולות RNA ב מקורי והרפתקאות אלקטרופורזה ג’ל אלקטרופורזה (PAGE) ג’לים. זו שיטת הצביעת כוללת ג’ל לטבילה במאגר המכיל אשלגן ו-TO1-Biotin. רנ א מנגו aptamers הם G-ארבעה מבוססי plex ו אשלגן נדרש כדי לייצב מבנים כאלה. באמצעות RNA ששועתק מ מינימלי קידוד מנגו תבניות DNA (לראות את מדור הפרוטוקול), אנחנו יכולים פשוט לזהות מעט ככל 62.5 fmol של RNA ב ג’לים מקומיים ו 125 fmol של RNA ב-הרפתקאות ג ‘ לים, באמצעות פרוטוקול מכתים ישירה. בניגוד לכתמי חומצות גרעין לא ספציפיות (ראה טבלת חומרים, המכונה SG מכאן), אנחנו יכולים לזהות בבירור מנגו-rna מתויג גם כאשר ריכוזים גבוהים של רנ א מתויג סך קיימים במדגם.

Protocol

1. הכנת הריאגנטים TO1-ביוטין הפתרון החותמות (ג’ל צביעת פתרון) לעשות 1 L של 1 מטר מאגר פוספט ב-pH 7.2 בגובה 25 ° c על ידי הוספת 342 mL של 1 M של Na2hpo4 ו 158 ML של 1 m נה2PO4. להתאים את ה-pH ל 7.2 ב 50 mM על ידי הוספת פתרון פוספט מתאים. מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר ואחסן את ?…

Representative Results

קצר מנגו-tagged RNAs הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול. בהנחה כי הזריחה בתנאים denaturing יהיה קשה ביותר להתבונן בשל הנוכחות של אוריאה ב ג’לים, אנו הראשונים לחקור את ההתנגדות של aptamers מנגו כדי אוריאה, אשר משמש חומצה גרעין denaturant. מצאנו aptamers מנגו עמידים באופן משמעותי כדי לגבות את ריכוז אורי…

Discussion

יתרון משמעותי של תג פלורסנט מנגו הוא תג אחד ניתן להשתמש בדרכים מרובות. בהירות גבוהה ואהדה של aptamers אלה להפוך אותם שימושיים לא רק עבור הדמיית תא2 אלא גם עבור מחוץ גופית RNA או rnp טיהור4. לכן, הדמיה ג’ל מרחיב את רב-תכליתיות תג מנגו בצורה פשוטה. רגישות מנגו ג’ל הדמיה היא מעט…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לרזון קוג’ואו ואמיר אבדולאזדה על הסיוע הטכני שלהם ועל לנה דולגושינה על הגהה של כתב היד. המימון סופק עבור פרויקט זה על ידי מדעי הטבע הקנדי ומועצת המחקר ההנדסה (NSERC) מענק הפעלה P.J.U.

Materials

0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels LabRepCo 11956042
101-1000 µL  tips Fisher 02-707-511
20-200 µL low retention  tips Fisher Scientific 02-717-143
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 19:1) Bioreagents BP1406-1 Acute toxicity
Acrylamide:N,N'-methylenebisacrylamide (40% 29:1) Fisher BP1408-1 Acute toxicity
Agar Anachemia 02116-380
Aluminium backed TLC plate Sigma-Aldrich 1164840001
Amersham Imager 600 GE Healthcare Lifesciences 29083461
Ammonium Persulfate Biorad 161-0700 Harmful
BL21 cells NEB C2527H
Boric Acid ACP B-2940
Bromophenol Blue sodium salt Sigma B8026-25G
Chloloform ACP C3300
Dithiothreitol Sigma Aldrich Alcohols D0632-5G
DNase I ThermoFisher EN0525
EDTA Disodium Salt ACP E-4320
Ethanol Commerial  P016EAAN
Flat Gel Loading tips Costar CS004854
Formamide 99% Alfa Aesar A11076
Gel apparatus set with spacers and combs LabRepCo 41077017
Glass Dish with Plastic lid Pyrex 1122963 Should be large enough to fit your gel piece
Glycerol Anachemia 43567-540
HCl Anachemia 464140468
ImageQuanTL GE Healthcare Lifesciences 29000605
IPTG Invitrogen 15529-019
KCl ACP P-2940
MgCl2 Caledron 4903-01
MgSO4 Sigma-Aldrich M3409
NaCl ACP S-2830
NaOH BDH BDH9292
Orbital Rotator Lab-Line
Phenol Invitrogen 15513-039
Round Gel Loading tips Costar CS004853
Sodium Phosphate dibasic Caledron 8120-1
Sodium Phosphate monobasic Caledron 8180-01
SYBRGold ThermoFisher S11494
T7 RNA Polymerase ABM E041
TEMED Sigma-Aldrich T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotin Fluorophore ABM G955
Tris Base Fisher BP152-500
Tryptone Fisher BP1421-500
Tween-20 Sigma P9496-100
Urea Fisher U15-3
Xylene Cyanol Sigma X4126-10G
Yeast Extract Bioshop YEX401.500

References

  1. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. , (2014).
  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656 (2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J., et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. 生物化学. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
  9. Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies. Chemistry & Biology. 22, 649-660 (2015).
  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  11. A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303 (2018)
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
  15. Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay. RNA. 15, 724-731 (2009).

Play Video

Cite This Article
Yaseen, I. M., Ang, Q. R., Unrau, P. J. Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method. J. Vis. Exp. (148), e59112, doi:10.3791/59112 (2019).

View Video