Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

Mango ist ein RNA-Tagging-System, bestehend aus einem Satz von vier kleinen fluoreszierenden RNA-Aptamern, die fest (Nanomolarbindung) an einfache Derivate der Thiazol-Orange (TO1-Biotin, Abbildung 1A)^{1,2,3 binden} . Bei der Bindung wird die Fluoreszenz dieses Liganden je nach spezifischem Aptamer um das 1.000- bis 4.000-fache erhöht. Die hohe Helligkeit des Mango-Systems, das für Mango III die des verbesserten grünen Fluoreszenzproteins (eGFP) in Kombination mit der nanomolaren Bindungsaffinität der RNA Mango-Aptamer übertrifft, ermöglicht es, sowohl bei der Bildgebung als auch bei der Reinigung von RNA eingesetzt zu werden. Komplexe^2,4.

Die Röntgenstrukturen von Mango I⁵, II⁶und III⁷ wurden zu hoher Auflösung bestimmt, und alle drei Aptamer verwenden ein RNA-Quadruplex, um TO1-Biotin zu binden (Abbildung 1B–D). Die kompakten Kerne aller drei Aptamer werden über kompakte Adaptermotive aus der externen RNA-Sequenz isoliert. Mango I und II verwenden beide einen flexiblen GNRA-ähnlichen Schleifenadapter, um ihre Mango-Kerne mit einem beliebigen RNA-Duplex zu verbinden (Abbildung 1B, C). Im Gegensatz dazu verwendet Mango III ein starres Triplex-Motiv, um seinen Kern mit einer beliebigen RNA-Helix zu verbinden (Abbildung1D,violette Rückstände), während die Struktur von Mango IV derzeit nicht bekannt ist. Da der Ligandenbindungskern jedes dieser Aptamer durch diese Spiraladapter von der externen RNA-Sequenz getrennt ist, scheint es wahrscheinlich, dass sie alle einfach in eine Vielzahl von RNAs integriert werden können. Die bakterielle 6S-konforme RNA (Mango I), Komponenten des Hefespliceooms (Mango I) und der humanen 5S-RNA, U6-RNA und einerC/D-ScaRNA (Mango II und IV) wurden alle erfolgreich auf diese Weise 2^,8getaggt, was darauf hindeutet, dass viele biologische RNAs können mit dem RNA Mango Aptamer System markiert werden.

Denaturing und native Gele werden häufig verwendet, um RNAs zu studieren. Denaturing Gels werden häufig verwendet, um die RNA-Größe oder DIE RNA-Verarbeitung zu beurteilen, aber typischerweise erfordern im Falle eines nördlichen Blots beispielsweise mehrere langsame und sequenzielle Schritte, um ein Bild zu erzeugen. Während andere fluorogene RNA-Aptamer wie RNA Spinat und Brokkoli erfolgreich für die Gelbildgebung⁹eingesetzt wurden, besitzt bisher kein fluorogenes Aptamersystem die hohe Helligkeit und Affinität des Mango-Systems, was es von erheblichem Interesse macht. um die Gel-Imaging-Fähigkeiten von Mango zu untersuchen. In dieser Studie fragten wir uns, ob das RNA-Mango-System einfach auf die Gel-Bildgebung ausgedehnt werden könnte, da die Anregungs- und Emissionswellenlängen von TO1-Biotin (510 nm bzw. 535 nm) für die Bildgebung im eGFP-Kanal geeignet sind, der den meisten fluoreszierenden Gel-Scanning-Instrumentierung.

Das hier vorgestellte Post-Gel-Färbeprotokoll bietet eine schnelle Möglichkeit, Mango-markierte RNA-Moleküle in nativen und denaturing Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese-Gelen (PAGE) gezielt zu detektieren. Bei dieser Färbemethode werden Gele in einem Kalium- und TO1-Biotinpuffer einweichen. RNA Mango Aptamer sind G-Quadruplex-basiert und Kalium wird benötigt, um solche Strukturen zu stabilisieren. Mithilfe von RNA, die aus minimalen Mango-kodierenden DNA-Vorlagen transkribiert wurde (siehe Protokollabschnitt), können wir einfach nur 62,5 Fmol RNA in nativen Gelen und 125 Fmol RNA in denaturierenden Gelen erkennen, indem wir ein einfaches Färbeprotokoll verwenden. Im Gegensatz zu häufigen unspezifischen Nukleinsäureflecken (siehe Tabelle der Materialien, die von nun an auf SG verwiesen werden) können wir Mango-markierte RNA auch dann eindeutig identifizieren, wenn hohe Konzentrationen der gesamten nicht markierten RNA in der Probe vorhanden sind.