Summary

La macchiatura di Immunohistochemical fluorescente multiplex, Imaging e analisi in campioni istologici di linfoma

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

Qui descriviamo un protocollo per multiplex immunohistochemical fluorescente di colorazione e di imaging per la localizzazione simultanea di più antigeni tumore-associati nel linfoma. Questo protocollo può essere esteso all’analisi di colocalizzazione dei biomarcatori all’interno di tutte le sezioni di tessuto.

Abstract

Metodi di immunoistochimica (IHC) per l’analisi in situ di espressione della proteina da microscopia chiara sono un potente strumento per la ricerca sia gli scopi diagnostici. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione degli antigeni multipli in un singolo tessuto sezione utilizzando convenzionali cromogenico IHC è impegnativo. Multiplex imaging è particolarmente rilevante nella ricerca di linfoma e di diagnostica, dove gli indicatori devono essere interpretate nel contesto di un microambiente tumorale complesse. Qui descriviamo un protocollo per multiplex fluorescente IHC che macchia per permettere la valutazione quantitativa di bersagli multipli in tipi cellulari specifici di interesse nel linfoma. Il metodo copre gli aspetti della convalida dell’anticorpo, ottimizzazione dell’anticorpo, l’ottimizzazione multiplex con marcatori di sottotipi di linfoma, la colorazione dei vetrini di tessuto microarray (TMA) e la scansione delle diapositive, seguita da analisi dei dati, con specifico riferimento per linfoma. Spartiti per sia l’intensità media di un marcatore di interesse e la percentuale di positività, utilizzando questo metodo, vengono generati per facilitare ulteriormente l’analisi quantitativa. Multiplexing riduce al minimo l’utilizzo di esempio e vengono fornite informazioni spaziali per ogni indicatore di interesse.

Introduction

Neoplasie linfoidi sono causati dalla incontrollata proliferazione maligna dei linfociti. Queste cellule sono componenti fondamentali del sistema immunitario e si localizzano gli organi immuni primari e secondari, quali il midollo osseo, nei linfonodi, milza e altri sistema linfoide mucosa-collegato. Neoplasie linfoidi sono un gruppo eterogeneo di disordini che sono classificati basato su una costellazione di caratteristiche, tra cui morfologia, immunofenotipo, caratteristiche genetiche e presentazione clinica. Mentre ogni parametro svolge un ruolo, lignaggio rimane una caratteristica distintiva e costituisce la base per il sistema di classificazione del WHO che riconosce neoplasma derivati dalle cellule B, cellule T e natural killer (NK) cellule1.

Chiave per la classificazione di linfoma è stata la caratterizzazione degli anticorpi contro gli indicatori della superficie del leucocita dei vari sottotipi di linfociti2. Immunohistochemistry (IHC) è stato tradizionalmente usato per l’analisi di tali indicatori e si basa sul principio del riconoscimento antigene-anticorpo specifico per rilevare molecole cellulari e tissutali che possono essere visualizzati attraverso il microscopio ottico 3. Tuttavia, l’identificazione di bersagli multipli su una singola diapositiva di convenzionale campo chiaro cromogenico multisala IHC ha limitazioni perché spesso è difficile distinguere attendibilmente più segnali di colore su una sezione di tessuto singolo — soprattutto per gli antigeni con un’ espressione molto bassa4. Valutazione visiva e quantificazione di colorazione può anche essere soggettivi, causando la variabilità nella interpretazione analisi e dati5.

Di conseguenza, IHC convenzionale su campioni di formalina-fisse, paraffina (FFPE) non è fattibile per la rilevazione simultanea di più destinazioni in immunologicamente diverse malattie come il linfoma. Inoltre, distinguendo i linfociti neoplastici dalle cellule immuni circostante è spesso impreciso. Questo ostacola studi esaminando la rilevanza di nuovi biomarcatori nel linfoma. In questo contesto, multisala fluorescente IHC (mf-IHC) rappresenta un’alternativa promettente poiché permette la valutazione quantitativa della coexpression di antigene e un rapporto spaziale con maggiore precisione, conservando limitato campioni6,7. Quando questa tecnologia di imaging è una partnership con il software di analisi di immagine digitale, l’interpretazione dei dati è reso più efficiente e facilita lo studio del tumore e microambiente eterogeneità8,9. In questo protocollo, un basati su microarray immunofluorescenza (IF) multiplexing metodo viene applicato per amplificare il segnale ed è compatibile con qualsiasi anticorpo IHC-convalidato da qualsiasi specie di ospiti, anche quelli sviluppati nella stessa specie5,7 , 10. il protocollo basato su microarray permette per la coniugazione diretta del fluoroforo al tessuto di interesse affinché l’anticorpo primario e secondario possa essere rimossi dopo ogni passaggio, consentendo l’applicazione sequenza di macchie multiple senza cross-reattività dell’anticorpo.

Una strategia di “multiplex” sarà utile per stimare la prognosi ed il trattamento risultati identificando obiettivi e loro modelli variant immunologiche nei linfomi. Multisala fluorescenti IHC è stato applicato nel nostro laboratorio per lo studio di un pannello di marcatori di T e dei linfociti B e T-follicolare helper nel linfoma a cellula T angioimmunoblastic (AITL), un sottotipo di un linfoma a cellula T periferico caratterizzato da aggressivo clinica comportamento e tumore eterogeneità11. L’utilità di questo metodo è illustrato anche nel linfoma diffuso della B-cellula grande (DLBCL) dove la segnalazione aumentata di un recettore della B-cellula con espressione simultanea di C-MYC e BCL-2 suggerisce il potenziale impiego terapeutico di inibizione di chinasi della tirosina di Bruton 12 .

Qui descriviamo l’intero protocollo dalla convalida dell’anticorpo alla selezione dei tessuti di controllo appropriato e multiplexing con linfoma FFPE tessuti, con un’eventuale analisi di vetrini colorati utilizzando una scansione automatizzata imaging quantitativo patologia sistema.

Protocol

Tutti i tessuti utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti sotto Singapore NHG dominio specifico Review Board B studiare 2014/00693. 1. selezione e validazione degli anticorpi Nota: Prima di procedere con la creazione di qualsiasi pannello multiplex, assicurarsi che tutti gli anticorpi macchiare robustamente, identificare solo l’antigene target di interesse. L’obiettivo è quello di selezionare gli anticorpi che riconoscono specificamente l’antigene di intere…

Representative Results

immagini di MF-IHC per un campione DLBCL con C-MYC e riorganizzazione di gene BCL2 (doppio-colpisca linfoma) sono mostrati nella Figura 1. La figura 2 illustra le immagini simulate campo chiaro immunohistochemical. Figura 3 indica la generazione dei dati di percentuale. Figura 4 Visualizza i dettagli di una formula mediana per la generazione di dati numerici. <strong cla…

Discussion

MF-IHC ha il potenziale per abilitare i patologi per perfezionare diagnosticcriteria in patologia linfoide e di analizzare il ruolo dei biomarcatori in tipi cellulari specifici verso un pronostico del risultato clinico. Come un nuovo metodo di ricerca, mf-IHC è sempre più applicate all’identificazione quantitativa e spaziale dei parametri immuni multipli del tumore le cellule17. La rilevazione di mf-IHC per la co-espressione di biomarcatori del tumore ha dimostrata di essere affidabile e riprodu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.-B.N. e a.d.j. sono supportati da National Medical Research Consiglio transizione Awards di Singapore Ministero della salute (NMRC/TA/0020/2013 e NMRC/TA/0052/2016). Gli autori riconoscono un Yong Siew Yoon Research Grant per A.D.J National University Cancer Institute di Singapore verso l’acquisto di un microscopio di imaging spettrale di Vectra. Questo studio è approvato dal Singapore NHG dominio specifico Review Board B (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

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Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

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