Summary

Marquage immunohistochimique Fluorescent multiplexé, l’imagerie et l’analyse des échantillons histologique du lymphome

Published: January 09, 2019
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Summary

Nous décrivons ici un protocole pour multiplex immunohistochemical fluorescent de coloration et d’imagerie pour la localisation simultanée de plusieurs antigènes associés aux cancer des lymphomes. Ce protocole peut être étendu à l’analyse de colocalisation de biomarqueurs dans toutes les coupes de tissus.

Abstract

Immunohistochimie (IHC) méthodes pour l’analyse in situ d’expression de la protéine au microscope photonique sont un outil puissant pour la recherche et des fins de diagnostic. Cependant, la visualisation et la quantification des antigènes multiples dans une section de tissu unique aide IHC chromogène conventionnel est difficile. L’imagerie multiplexé est particulièrement pertinent dans la recherche de lymphome et de diagnostics, où les marqueurs devront être interprétées dans le contexte d’un micro-environnement tumoral complexe. Nous décrivons ici un protocole pour multiplexé IHC fluorescent coloration afin de permettre l’évaluation quantitative de cibles multiples dans les types spécifiques de cellules d’intérêt dans le lymphome. La méthode couvre les aspects de validation de l’anticorps, l’optimisation de l’anticorps, l’optimisation multiplexe avec des marqueurs des sous-types de lymphomes, la coloration des lames de tissu microarray (TMA) et la numérisation des diapositives, suivie d’analyse de données, avec spécifiques référence de lymphome. En utilisant cette méthode, partitions pour les deux l’intensité moyenne d’un marqueur d’intérêt et la pourcentage de positivité sont générées afin de faciliter la poursuite des analyses quantitatives. Multiplexage minimise l’utilisation de l’échantillon et fournit de l’information spatiale pour chaque marqueur d’intérêt.

Introduction

Les tumeurs lymphoïdes sont causés par la prolifération maligne anarchique des lymphocytes. Ces cellules sont des composantes essentielles du système immunitaire et localiser les organes immunitaires primaires et secondaires, tels que la moelle osseuse, ganglions lymphatiques, la rate et autre système lymphoïde associé aux muqueuses. Les tumeurs lymphoïdes sont un groupe hétérogène d’affections qui sont classées basé sur une constellation de caractéristiques, dont la morphologie lymphoblastiques, les caractéristiques génétiques et présentation clinique. Tandis que chaque paramètre joue un rôle, lignée reste une caractéristique déterminante et constitue la base pour le système de classification OMS qui reconnaît les néoplasmes dérivés de cellules B et les lymphocytes T natural killer (NK) cellules1.

Clé à la classification du lymphome est la caractérisation des anticorps contre les marqueurs de surface de leucocytes des différents sous-types de lymphocytes2. L’immunohistochimie (IHC) a été utilisé traditionnellement pour l’analyse de ces marqueurs et repose sur le principe de la reconnaissance de l’antigène-anticorps spécifique pour détecter des molécules axée sur les cellules et les tissus qui peuvent être visualisées par le microscope photonique 3. Toutefois, l’identification de cibles multiples sur une seule diapositive, par conventionnel lumineux-zone chromogène multiplex IHC a des limites car il est souvent difficile de distinguer de multiples signaux de couleur sur une section de tissu unique fiable — surtout pour les antigènes avec une expression très faible4. Évaluation visuelle et la quantification de coloration peuvent aussi être subjectives, provoquant la variabilité dans l’analyse et les données interprétation5.

IHC classique sur des échantillons (FFIP) fixés au formol, paraffine n’est donc pas possible pour la détection simultanée de multiples cibles immunologiquement diverses maladies comme le lymphome. En outre, la distinction lymphocytes néoplasiques des cellules immunitaires environnantes est souvent imprécise. Cela empêche les études examinant la pertinence de nouveaux biomarqueurs dans le lymphome. Dans ce contexte, multiplexe fluorescent IHC (mf-IHC) offre une alternative prometteuse, car il permet l’évaluation quantitative de la coexpression de l’antigène et une relation spatiale avec une plus grande précision tout en conservant un limité d’échantillons6,7. Lorsque cette technologie d’imagerie est en partenariat avec le logiciel d’analyse de l’image numérique, l’interprétation des données est rendue plus efficace et facilite l’étude de la tumeur et microenvironnement hétérogénéité8,9. Dans ce protocole, une base tyramide immunofluorescence (IF) méthode de multiplexage est appliquée pour amplifier le signal et est compatible avec n’importe quel anticorps IHC-validé de toute espèce d’hôte, même ceux mis au point à la même espèce5,7 , 10. le protocole tyramide permet la conjugaison directe du fluorophore au tissu d’intérêt pour que les anticorps primaires et secondaires peuvent être dépouillés après chaque étape, permettant l’application séquentielle de plusieurs taches sans la réactivité des anticorps.

Une stratégie multiplexée sera utile pour prédire le pronostic et le traitement des résultats par l’identification des cibles et leurs profils immunologiques variant dans les lymphomes. Multiplexe fluorescent IHC a été appliquée dans notre laboratoire pour l’étude d’un panel de marqueurs T et les lymphocytes B et T-folliculaire d’assistance dans le lymphome de T-cellule d’angioimmunoblastic (AITL), un sous-type d’un lymphome à cellules T périphérique caractérisée par agressivité clinique comportement et tumeur hétérogénéité11. L’utilité de cette méthode est également illustrée en diffus grand lymphome B (LMNH) où la signalisation accrue d’un récepteur des cellules B avec l’expression simultanée de C-MYC et BCL-2 suggère l’utilisation thérapeutique potentielle d’inhibition de la tyrosine kinase de Bruton 12 .

Nous décrivons ici l’ensemble du protocole de validation de l’anticorps à la sélection des tissus appropriés de contrôle et de multiplexage à l’aide de lymphome FFIP tissus, avec une éventuelle analyse de lames colorées en utilisant un balayage automatisé d’imagerie quantitative pathologie système.

Protocol

Tous les tissus utilisés dans le présent protocole ont été obtenus sous la Singapour NHG domaine spécifique Review Board B étudier 2014/00693. 1. sélection et Validation des anticorps Remarque : Avant de procéder à la mise en place d’un panneau de multiplex, assurez-vous que tous les anticorps tachent robuste, identifiant uniquement l’antigène cible d’intérêt. Le but est de sélectionner des anticorps qui reconnaissent spécifiquement l’antigène …

Representative Results

MF-IHC image pour un échantillon de LMNH avec C-MYC et réarrangement génique de BCL2 (double-hit lymphome) sont affichées à la Figure 1. La figure 2 illustre les images simulées lumineux-zone immunohistochimique. La figure 3 indique la génération des données de pourcentage. La figure 4 affiche les détails d’une formule médiane pour la génération de donnée…

Discussion

MF-IHC a le potentiel pour permettre des pathologistes d’affiner diagnosticcriteria en pathologie lymphoïde et d’analyser le rôle des biomarqueurs dans les types spécifiques de cellules vers une prévision des résultats cliniques. Comme une nouvelle méthode de recherche, mf-IHC est plus appliquée à la détermination quantitative et spatiale des multiples paramètres immunitaires des cellules de tumeur17. La détection de mf-IHC pour la co-expression de biomarqueurs de la tumeur s’est …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.-B.N. et A.D.J. sont pris en charge par nationale médicale recherche Conseil Transition Awards le Singapour ministère de la santé (NMRC/TA/0020/2013 et NMRC/TA/0052/2016). Les auteurs reconnaissent une subvention de recherche de Yoon Yong Siew à A.D.J. de l’Université nationale du Cancer Institut de Singapour pour l’achat d’un microscope d’imagerie spectral de Vectra. Cette étude est approuvée par le Singapore NHG domaine spécifique Review Board B (2014/00693).

Materials

Antibody diluent DAKO REF S3022 Blocking
Peroxidase Blocking Solution DAKO S2023 For peroxide blocking
Vectra multispectral automated microscope Perkin Elmer Vectra2.0.8 Spectral imaging
absolute Ethanol EMSURE 1.00983.2500 Ethyl alcohol for rehydration
Amplification Diluent PERKIN ELMER FP1135 Fluorophore diluent buffer
Anti-Mouse IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF822001EA Secondary antibody
Anti-Rabbit IgG [Goat] HRP-Labeled PERKIN ELMER NEF812001EA Secondary antibody
BCL2 DAKO clone 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693) primary antibody
BCL6 LEICA NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429) primary antibody
CD20 DAKO Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055) primary antibody
c-MYC ABCAM Y 69 clone ab32072 (Lot NO.GR29511133)(RRID-AB731658) primary antibody
Cy 5 PERKIN ELMER FP1171 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Graphpad Prism 7 Graph pad Statisitcal software
HistoClear Clearing Agent SIGMA H2779-1L Histoclear for dewaxing and clearing
inForm Advanced
Image Analysis Software
Perkin Elmer Inform Software 2.2.1 Data Analysis software
KI67 DAKO Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699) primary antibody
KOS MILESTONE multifunctional tissue processor Milestone Microwave for Heat induced epitope retrieval
Microwave PANASONIC NN-ST651M Microwave stripping
Mowiol SIGMA ALDRICH 81381 Aldrich Mowiol® 4-88 mounting media
Opal 570 PERKIN ELMER FP1488 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal520 PERKIN ELMER FP1487B21 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal540 PERKIN ELMER FP1494 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Opal620 PERKIN ELMER FP1495 Appropriate tyramide based fluorescent reagent
Poly-L-lysine coated slide FISHER SCIENTIFIC 120-550-15 Slide for tissue section adhesion in routine histological use
Spectral DAPI PERKIN ELMER FP1490 nucleic acid stain
Target Retrieval Solution, pH9.0(10x) DAKO S2367 For HIER
Tris Buffer saline (TBS) 1st BASE BUF3030 20X4L for buffer wash
Tween 20 SIGMA ALDRICH P1379-1L Tween

References

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Cite This Article
Hong, G., Fan, S., Phyu, T., Maheshwari, P., Hoppe, M. M., Phuong, H. M., de Mel, S., Poon, M., Ng, S., Jeyasekharan, A. D. Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma. J. Vis. Exp. (143), e58711, doi:10.3791/58711 (2019).

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