Utilisation de résonance paramagnétique électronique dans des échantillons biologiques à température ambiante et à 77 K
Summary
Par spectroscopie de résonance paramagnétique (EPR) est une méthode non équivoque pour mesurer des radicaux libres. L’utilisation de sondes de spin sélectif permet une détection des radicaux libres dans les différents compartiments cellulaires. Nous présentons une méthode pratique et efficace pour collecter des échantillons biologiques qui facilitent le traitement, stockage et transfert des échantillons pour des mesures de l’EPR.
Abstract
La détection précise et spécifique des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les différents compartiments cellulaires et tissulaires est essentielle à l’étude de l’oxydo-réduction réglementées de signalisation dans les milieux biologiques. Spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) est la méthode directe d’évaluer sans ambiguïté les radicaux libres. Son avantage est qu’il détecte des niveaux physiologiques des espèces spécifiques avec une grande spécificité, mais elle requiert la technologie spécialisée, préparation minutieuse et des contrôles appropriés afin d’assurer une interprétation précise des données. Sondes de spin hydroxylamine cyclique réagissent sélectivement avec superoxyde ou autres radicaux pour générer un signal nitroxyde pouvant être quantifiées par spectroscopie RPE. Sondes de spin perméable à la cellule et sondes de spin conçus pour accumuler rapidement dans les mitochondries permettent la détermination de la concentration de superoxyde dans les différents compartiments cellulaires.
Dans les cellules cultivées, l’utilisation de 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine cellulaires perméables (CMH) avec et sans prétraitement de cellule-imperméable superoxyde dismutase (SOD) ou de cellules perméables PEG-SOD, permet la différenciation des extracellulaire de superoxyde cytosolique. Le 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido mitochondrial] pipéridinium dichlorure (mito-TEMPO-H) permet de mesurer des ROS mitochondriale (principalement le superoxyde).
Sondes de spin et spectroscopie RPE peuvent également être appliquées en vivo modèles. Superoxyde peut être détectée en fluides extracellulaires comme le sang et le liquide alvéolaire, ainsi que les tissus tels que les tissus pulmonaires. Plusieurs méthodes sont présentées pour traiter et stocker les tissus pour les mesures de l’EPR et livrer de sonde 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine en intraveineuse (CPH) spin in vivo. Tandis que les mesures peuvent être réalisées à température ambiante, échantillons obtenus à partir des modèles in vitro et in vivo peuvent également être stockées à-80 ° C et analysés par EPR à 77 K. Les échantillons peuvent être stockés dans l’écurie de tubes spécialisés à-80 ° C et exécutées à 77 K pour permettre une pratique, efficace et une méthode reproductible qui facilite le stockage et transfert des échantillons.
Introduction
Alors que les mesures du stress oxydatif et les espèces réactives de l’oxygène sont importants pour l’étude de diverses maladies à travers tous les systèmes organiques, la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) est difficile en raison d’une courte demi-vie et forte réactivité. Une technique de résonance paramagnétique (RPE) des électrons est la méthode la plus claire pour la détection des radicaux libres. Sondes de spin ont des avantages sur des sondes fluorescentes plus couramment utilisés. Bien que des sondes fluorescentes sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et offrant une détection rapide et sensible de ROS, ils ont de sérieuses limites à cause des signaux artéfactuelle, une incapacité à calculer les concentrations de ROS et un manque général de spécificité1 .
Pour faciliter l’utilisation de l’EPR pour des études biologiques, une variété de spin sondes ont été synthétisés qui permet de mesurer une gamme d’espèces radicalaires biologiquement pertinente ainsi que pO2, pH et redox indique2,3, 4,5,6,7. Pièges à spin ont également été développés pour capter les radicaux éphémères et forme longue durée de vie des adduits, qui facilite la détection par RPE8. Les deux classes (sondes de spin et pièges à spin) ont des avantages et des limites. Une classe couramment utilisée des sondes de spin sont des hydroxylamines cycliques, qui sont des EPR en silence et réagissent avec des radicaux pour former un nitroxyde stable de courte durée. Hydroxylamines cycliques réagissent avec le superoxyde 100 fois plus vite que les pièges à spin, ce qui leur permet de rivaliser avec les antioxydants cellulaires, mais ils manquent de spécificité et nécessitent l’utilisation de contrôles appropriés et les inhibiteurs d’identifier les espèces radicalaires ou source responsable pour le signal nitroxyde. Tandis que spin intercepte la spécificité de la pièce, avec distinctes spectrale que modèles selon l’espèce pris au piège, ils ont cinétique lente pour superoxyde spin piégeage et sont sujette à la biodégradation du radical adduits. Demandes de piégeage de spin ont été bien étudiées dans la recherche biomédicale9,10,11,12,13.
L’objectif de ce projet est de démontrer les méthodes pratiques d’EPR pour concevoir des expériences et préparation des échantillons pour détecter des superoxyde à l’aide de spin des sondes dans les différents compartiments cellulaires in vitro et dans des tissus différents compartiments in vivo. Plusieurs manuscrits ont publié les protocoles pertinents à atteindre ces objectifs, en utilisant des sondes de spin ciblées perméable à la cellule et cellule-imperméable mitochondriale au tissu de cible différents compartiments cellulaires in vitro et processus pour analyse dans des modèles murins 14 , 15. nous inspirer de ce corpus de textes en validant une approche pour mesurer la superoxyde en utilisant une sonde de spin (CMH) 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine dans différents compartiments cellulaires in vitro afin d’assurer la précision mesures, mettant en évidence les éventuels problèmes techniques qui peuvent biaiser les résultats. Nous fournissons également des méthodes permettant d’effectuer des mesures de l’EPR dans le sang, le liquide de lavage broncho-alvéolaire et du tissu pulmonaire à l’aide de la sonde de spin CMH. Ces études comparent différentes méthodes pour traiter les tissus ainsi que pour présenter une méthode pour injecter une autre sonde de spin, CPH, à des souris avant la récolte de tissus. Enfin, nous développons une méthode pratique pour stocker les échantillons dans un tube de polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour permettre le stockage et le transfert des échantillons avant mesures EPR à 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’évaluation de la production de radicaux libres dans les milieux biologiques est importante redox compréhension réglementés de signalisation de santé et la maladie, mais la mesure de ces espèces est très difficile en raison de la courte demi-vie des radicaux libres et technique limites avec les méthodes couramment utilisées. RPE est un outil précieux et puissant en biologie de l’oxydo-réduction, comme c’est la méthode seulement sans ambiguïté pour la détection des radicaux libres. Dans ce projet, no…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la faculté de l’Université du Colorado de médecine Dean award de l’Infrastructure de recherche stratégique, R01 HL086680-09 et 1R35HL139726-01, à la bourse E.N.G. et UCD CFReT (HE). Les auteurs remercient Dr Sandra Eaton et Dr. Gareth Eaton (Université de Denver), Dr Gerald Rosen et Dr. Joseph P. Kao (Université du Maryland) et Dr Sujatha Venkataraman (Université du Colorado, Denver) pour des discussions utiles et Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie et Ivy McDermott (Université du Colorado, Denver) pour le support technique.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
References
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. 生物化学. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
