Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K
Summary
Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.
Abstract
De nauwkeurige en specifieke detectie van reactieve zuurstof soorten (ROS) in verschillende compartimenten voor cellulaire en weefsel is essentieel voor de studie van redox-gereglementeerde signalering in biologische instellingen. Elektron paramagnetisch resonantie spectroscopie (EPR) is de enige directe methode te beoordelen van vrije radicalen ondubbelzinnig. Het voordeel is dat fysiologische niveaus van specifieke soorten met een hoge specificiteit wordt gedetecteerd, maar het vereist gespecialiseerde technologie, zorgvuldige monstervoorbereiding en passende controles om ervoor te zorgen nauwkeurige interpretatie van de gegevens. Cyclische hydroxylamine spin sondes reageren selectief met superoxide of andere radicalen voor het genereren van een nitroxide-signaal dat kan worden gekwantificeerd door EPR spectroscopie. Cel-permeabele spin sondes en spin sondes ontworpen snel ophopen in de mitochondriën toestaan voor de bepaling van superoxide concentratie in andere cellulaire compartimenten.
In gekweekte cellen, het gebruik van cel permeabele 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) samen met en zonder cel-ondoordringbare superoxide dismutase (SOD) voorbehandeling of gebruik van cel-permeabele PEG-SOD, voorziet in de differentiatie van extracellulaire van cytosolische superoxide. De mitochondriale 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] piperidinium dichloride (mito-TEMPO-H) zorgt voor de meting van mitochondriale ROS (overwegend superoxide).
Spin sondes en EPR spectroscopie kunnen ook worden toegepast op de in vivo modellen. Superoxide kan worden opgespoord in extracellulaire vloeistoffen zoals bloed en alveolaire vloeistof, evenals weefsels zoals longweefsel. Verschillende methoden worden gepresenteerd voor het verwerken en opslaan van weefsel voor EPR metingen en leveren van intraveneuze 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) spin sonde in vivo. Terwijl metingen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, kunnen monsters verkregen van in vitro en in vivo modellen ook worden opgeslagen bij-80 ° C en geanalyseerd door EPR op 77 K. De monsters kunnen worden opgeslagen in gespecialiseerde buis stal bij-80 ° C en op 77 K om een praktische, efficiënte, en reproduceerbare methode die vergemakkelijkt opslaan en overdragen monsters worden uitgevoerd.
Introduction
Terwijl maatregelen van oxidatieve stress en reactieve zuurstof soorten belangrijk voor de studie van diverse ziekten over alle orgaansystemen zijn, is de detectie van reactieve zuurstof soorten (ROS) uitdagend als gevolg van een korte halfwaardetijd en hoge reactiviteit. Een elektron paramagnetisch resonantie (EPR) techniek is de meest duidelijke methode voor het opsporen van vrije radicalen. Spin sondes hebben voordelen ten opzichte van de meer gangbare TL sondes. Hoewel fluorescerende sondes zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te gebruiken en bieden snelle, gevoelige detectie van ROS, hebben ze ernstige beperkingen als gevolg van artefactuele signalen, een onvermogen om ROS concentraties, en een algemeen gebrek aan specificiteit1 te berekenen .
Ter vergemakkelijking van het gebruik van EPR voor biologische studies, een aantal spin sondes hebben al gesynthetiseerd die een aantal biologisch relevante vrije radicalen soorten, alsmede pO2, pH en redox meten kan staat2,3, 4,5,6,7. Spin traps zijn ook ontwikkeld om te vangen kortstondige radicalen en vorm lang-leven adducten, die detectie door EPR8vergemakkelijkt. Beide klassen (spin sondes en spin traps) hebben voordelen en beperkingen. Een veelgebruikte klasse van spin sondes zijn cyclische hydroxylamines, die zijn EPR-stille en reageren met kortstondige radicalen vormen een stabiele nitroxide. Cyclische hydroxylamines reageren met superoxide 100 keer sneller dan spin traps, inschakelen van hen om te concurreren met cellulaire antioxidanten, maar zij gebrek aan specificiteit en vereisen het gebruik van de passende controles en remmers radicale soorten of bron te identificeren verantwoordelijk voor het nitroxide signaal. Terwijl de spin traps tentoonstelling specificiteit, met verschillende spectrale dat patronen is afhankelijk van de gevangen soorten, ze hebben langzame kinetiek superoxide spin overlapping en zijn gevoelig voor biologische afbraak van de radicale adducten. Toepassingen voor overvulling van de spin zijn geweest goed gedocumenteerd in biomedisch onderzoek9,10,11,12,13.
Het doel van dit project is om aan te tonen van praktische EPR methoden voor het ontwerpen van experimenten en voorbereiding van monsters te detecteren superoxide met behulp van spin sondes in andere cellulaire compartimenten in vitro en in verschillende weefsels compartimenten in vivo. Verschillende manuscripten hebt protocollen die relevant zijn voor deze doelstellingen, met behulp van cel-permeabele, cel-ondoordringbaar en mitochondriale gerichte spin sondes naar andere cellulaire compartimenten in vitro en proces doelweefsel p.a. in muismodellen gepubliceerd 14 , 15. we voortbouwen op dit lichaam van literatuur door het valideren van een aanpak voor het meten van superoxide met behulp van een 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) spin sonde in het andere cellulaire compartimenten in vitro om ervoor te zorgen nauwkeurige metingen, benadrukken de mogelijke technische problemen kunnen vertekenen resultaten. Wij bieden ook methoden voor het uitvoeren van metingen van de EPR in bloed, bronchoalveolar lavage vloeistof en longweefsel met behulp van de CMH spin sonde. Deze studies vergelijken verschillende methoden voor het verwerken van de weefsels, alsmede het presenteren van een methode om een andere spin sonde, CPH, injecteren muizen vóór de oogst van weefsel. Ten slotte, ontwikkelen wij een praktische methode voor het opslaan van monsters in polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen te maken voor de opslag en overslag van monsters vóór EPR metingen op 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beoordeling van de productie van vrije radicalen in biologische instellingen is belangrijk in begrip redox geregeld signalering bij gezondheid en ziekte, maar de maatregel van deze soorten is zeer uitdagend vanwege de korte halfwaardetijd van vrije radicalen soorten en technische beperkingen met veelgebruikte methoden. EPR is een waardevolle en krachtige tool in de redox biologie, want het is de alleen ondubbelzinnig methode voor het opsporen van vrije radicalen. In dit project, tonen we praktische EPR methoden voor h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Colorado-School van geneeskunde Dean’s strategische onderzoeksinfrastructuur award, R01 HL086680-09 en 1R35HL139726-01, E.N.G. en UCD CFReT fellowship Award (HE). De auteurs bedanken Dr. Sandra Eaton en Dr. Gareth Eaton (Universiteit van Denver), Dr. Gerald Rosen en Dr. Joseph P. Kao (Universiteit van Maryland), Dr. Sujatha Venkataraman (Universiteit van Colorado Denver) voor nuttige discussies en Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie en Ivy McDermott (Universiteit van Colorado Denver) voor technische ondersteuning.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
References
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magnetic Resonance in Medicine. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magnetic Resonance in Chemistry. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., et al. Imaging disulfide dinitroxides at 250 MHz to monitor thiol redox status. Journal of Magnetic Resonance. 260, 77-82 (2015).
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic-Resonance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Epel, B., et al. Imaging thiol redox status in murine tumors in vivo with rapid-scan electron paramagnetic resonanc. Journal of Magnetic Resonance. 276, 31-36 (2017).
- Legenzov, E. A., Sims, S. J., Dirda, N. D. A., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y. Disulfide-Linked Dinitroxides for Monitoring Cellular Thiol Redox Status through Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy. 生物化学. 54 (47), 6973-6982 (2015).
- Abbas, K., et al. Medium-throughput ESR detection of superoxide production in undetached adherent cells using cyclic nitrone spin traps. Free Radical Research. 49 (9), 1122-1128 (2015).
- Dikalov, S. I., et al. Distinct roles of Nox1 and Nox4 in basal and angiotensin II-stimulated superoxide and hydrogen peroxide production. Free Radical Biology and Medicine. 45 (9), 1340-1351 (2008).
- Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor’ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radical Research. 45 (4), 417-430 (2011).
- Dikalova, A. E., et al. Therapeutic Targeting of Mitochondrial Superoxide in Hypertension. Circulation Research. 107 (1), 106-116 (2010).
- Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron Paramagnetic Resonance Measurements of Reactive Oxygen Species by Cyclic Hydroxylamine Spin Probes. Antioxidants & Redox Signaling. , (2017).
- Sharma, S., et al. L-Carnitine preserves endothelial function in a lamb model of increased pulmonary blood flow. Pediatric Research. 74 (1), 39-47 (2013).
- Berg, K., Ericsson, M., Lindgren, M., Gustafsson, H. A High Precision Method for Quantitative Measurements of Reactive Oxygen Species in Frozen Biopsies. PloS One. 9 (3), (2014).
- Kozlov, A. V., et al. EPR analysis reveals three tissues responding to endotoxin by increased formation of reactive oxygen and nitrogen species. Free Radical Biology and Medicine. 34 (12), 1555-1562 (2003).
- Van Rheen, Z., et al. Lung Extracellular Superoxide Dismutase Overexpression Lessens Bleomycin-Induced Pulmonary Hypertension and Vascular Remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (4), 500-508 (2011).
- Mouradian, G. C., et al. Superoxide Dismutase 3 R213G Single-Nucleotide Polymorphism Blocks Murine Bleomycin-Induced Fibrosis and Promotes Resolution of Inflammation. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 56 (3), 362-371 (2017).
- Dikalov, S. I., Li, W., Mehranpour, P., Wang, S. S., Zafari, A. M. Production of extracellular superoxide by human lymphoblast cell lines: comparison of electron spin resonance techniques and cytochrome C reduction assay. Biochem Pharmacol. 73 (7), 972-980 (2007).
- Kozuleva, M., et al. Quantification of superoxide radical production in thylakoid membrane using cyclic hydroxylamines. Free Radical Biology and Medicine. 89, 1014-1023 (2015).
- Chen, K., Swartz, H. M. Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells. Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).
