Verwendung der Elektron-paramagnetische Resonanz in biologischen Proben bei Umgebungstemperatur und 77 K
Summary
Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Spektroskopie ist eine eindeutige Methode, freie Radikale zu messen. Die Verwendung von selektive Spin Sonden kann für die Erkennung von freien Radikalen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Wir präsentieren Ihnen eine praktische und effiziente Methode zur biologische Proben zu sammeln, die zu erleichtern, Behandlung, Speicherung und Übertragung von Proben für EPR-Messungen.
Abstract
Die genaue und spezifische Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in verschiedenen Mobilfunk- und Gewebe Kompartimenten ist wichtig für die Untersuchung von Redox-regulierten Signalisierung in biologischen Einstellungen. Elektron-paramagnetische Resonanz-Spektroskopie (EPR) ist die einzige direkte Methode, um freie Radikale eindeutig zu beurteilen. Sein Vorteil ist, dass physiologische Ebenen von bestimmten Arten mit hoher Spezifität erkennt, aber es erfordert spezialisierte Technologie, sorgfältige Probenvorbereitung und entsprechende Kontrollen, um genaue Interpretation der Daten zu gewährleisten. Zyklische Hydroxylamin Spin Sonden reagieren selektiv mit Superoxid oder andere radikale ein Nitroxid-Signal generieren, die von EPR-Spektroskopie quantifiziert werden können. Zelle durchlässig Spin Sonden und Spin Sonden entwickelt, um schnell in den Mitochondrien sammeln ermöglichen die Bestimmung der Superoxid-Konzentration in verschiedenen zellulären Kompartimenten.
In kultivierten Zellen, die Verwendung der Zelle durchlässig 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) zusammen mit und ohne Handy-undurchlässig Superoxid Dismutase (SOD) Vorbehandlung oder Verwendung der Zelle durchlässig PEG-SOD, ermöglicht die Differenzierung der extrazellulären aus cytosolischen Superoxid. Die mitochondriale 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] Piperidinium Paraquatdichlorid (Mito-TEMPO-H) ermöglicht die Messung von mitochondrialen ROS (überwiegend Superoxid).
Spin-Sonden und EPR-Spektroskopie können auch auf in Vivo Modelle angewendet werden. Superoxid kann in extrazellulären Flüssigkeiten wie Blut und alveoläre Flüssigkeit sowie Gewebe wie Lungengewebe erkannt werden. Verschiedene Methoden werden vorgestellt, um zu verarbeiten und speichern Gewebe für EPR-Messungen und intravenöse 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) Spin Sonde in Vivozu liefern. Während Messungen bei Raumtemperatur durchgeführt werden können, können durch EPR bei 77 K. Proben aus in Vitro und in Vivo Modellen auch bei-80 ° C gelagert und analysiert werden Die Proben können in spezialisierten Schläuche stabil bei-80 ° C gelagert und laufen bei 77 K ermöglichen eine praktische, effiziente und reproduzierbare Methode, das erleichtert die Speicherung und Übertragung von Proben.
Introduction
Maßnahmen der oxidativen Stress und reaktive Sauerstoffspezies sind, zwar wichtig für die Untersuchung von verschiedenen Krankheiten auf alle Organsysteme ist die Detektion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch eine kurze Halbwertszeit und hohe Reaktivität anspruchsvoll. Eine Elektron-paramagnetische Resonanz (EPR)-Technik ist die am meisten eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. Spin-Sonden haben Vorteile gegenüber den häufig verwendeten fluoreszierenden Sonden. Obwohl fluoreszierende Sonden sind relativ preiswert und einfach zu bedienen und ermöglichen eine schnelle, empfindliche Erkennung von ROS, haben sie gravierende Einschränkungen aufgrund Serums Signale, die Unfähigkeit, ROS Konzentration und einen allgemeinen Mangel an Spezifität1 berechnen .
Für eine einfache Handhabung des EPR für biologische Studien besagt eine Vielzahl von Spin Sonden synthetisiert worden, die eine Reihe von biologisch relevante radikalische Spezies sowie pO-2, pH und Redox messen können2,3, 4,5,6,7. Spin fallen auch entwickelt wurden, um kurzlebige radikale einzufangen und Form langlebige Addukte, die Erkennung von EPR8erleichtert. Beide Klassen (Spin-Sonden und Spin Traps) haben Vorteile und Einschränkungen. Eine häufig verwendete Klasse von Spin-Sonden sind zyklische Hydroxylamines, die EPR-Silent und reagieren mit kurzlebigen radikalen eine stabile Nitroxid bilden. Zyklische Hydroxylamines mit Superoxid 100 Mal schneller reagieren als Spin fallen, damit zu konkurrieren mit zellulären Antioxidantien, aber es fehlt Ihnen Spezifität und erfordern den Einsatz von geeigneten Kontrollen und Inhibitoren, die radikale Art oder Quelle zu identifizieren verantwortlich für das Nitroxid-Signal. Während Spin Ausstellung Spezifität Traps, Addukte mit unterschiedlichen spektralen Mustern je nach Gattung gefangen, sie haben langsame Kinetik für Superoxid spin überfüllen und sind anfällig für biologischen Abbau der radikalen. Anwendungen für Spin Überfüllung wurden gut dokumentiert in der biomedizinischen Forschung9,10,11,12,13.
Das Ziel dieses Projektes ist es, praktische EPR-Methoden für die Gestaltung von Experimenten zeigen und Probenvorbereitung, Superoxid mit Spin zu erkennen-Sonden in verschiedenen zellulären Kompartimenten in Vitro und in verschiedene Gewebe Fächer in Vivo. Mehrere Handschriften wurden Protokolle für diese Ziele mit Zelle durchlässig, Zelle-undurchlässig und mitochondriale gezielte Spin Sonden zu verschiedenen zellulären Kompartimenten in Vitro und Prozess Zielgewebe zur Analyse in Mausmodellen veröffentlicht. 14 , 15. Wir bauen auf diesem Körper der Literatur durch die Überprüfung eines Ansatzes zur Messung der Superoxid mittels 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) Spin Sonde in verschiedenen zellulären Kompartimenten in-vitro- um genau zu gewährleisten Messungen, Hervorhebung mögliche technische Probleme, die die Ergebnisse verzerren können. Wir bieten auch Methoden zum Ausführen von EPR-Messungen im Blut, alvéolaire Lavage Fluid und Lungengewebe mit der CMH-Spin-Sonde. Diese Studien vergleichen verschiedene Methoden, um Gewebe zu verarbeiten sowie eine Methode, um ein weiteres Spin-Sonde, CPH, in Mäuse vor der Ernte Gewebe injizieren zu präsentieren. Schließlich entwickeln wir eine praktische Methode zum Speichern von Proben in Polytetrafluorethylen (PTFE) Schlauch ermöglicht die Speicherung und Übermittlung von Proben vor dem EPR-Messungen bei 77 K.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Bewertung der Produktion freier Radikale in den biologischen Einstellungen ist wichtig im Verständnis Redox geregelt Signalisierung in Gesundheit und Krankheit, aber das Maß dieser Arten ist sehr schwierig wegen der kurzen Halbwertszeit von freien Radikalen Arten und technische Einschränkungen mit häufig verwendeten Methoden. EPR ist eine wertvolle und mächtige Werkzeug in der Redox-Biologie, wie es die einzige eindeutige Methode zur Erkennung von freien Radikalen. In diesem Projekt zeigen wir praktische EPR Met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der University of Colorado School of Medicine Dean strategische Forschungsinfrastruktur Award, R01 HL086680-09 und 1R35HL139726-01, zu eng und UCD CFReT Fellowship Award (er) unterstützt. Die Autoren danken Dr. Sandra Eaton und Dr. Gareth Eaton (University of Denver), Dr. Gerald Rosen und Dr. Joseph P. Kao (University of Maryland), und Dr. Sujatha Venkataraman (University of Colorado Denver) für hilfreiche Diskussionen und Joanne Maltzahn, Ashley Trumpie und Ivy McDermott (University of Colorado Denver) für den technischen Support.
Materials
| DMEM | LifeTech | 10566-016 | cell culture media |
| Diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA) | Sigma Aldrich | D6518-5G | |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358-212 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate dibasic (HK2PO4 ) | Fisher Scientific | BP363-500 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| potassium phosphate monobasic (KH2PO4 ) | Sigma Aldrich | P-5379 | used to prepare 50 mM phosphate saline buffer according to Sigma aldrish |
| Krebs-Henseleit buffer (KHB) | (Alfa Aesar, Hill) | J67820 | |
| Bovine erythrocyte superoxide dismutase (SOD) | Sigma Aldrich | S7571-30KU | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P1585-1MG | Dissolve in DMSO |
| Antimycin A (AA) | Sigma Aldrich | A8674-25MG | Dissolve in Ethanol and store in glass vials(MW used is the averaged molecular weights for four lots) |
| 1-Hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CMH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-117-M050 | |
| 1-Hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine . HCl (CPH) | Enzo Life Sciences | ALX-430-078-M250 | |
| 1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethylpiperidine, 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido]piperidinium dichloride ( mito-TEMPO-H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-171-M005 | |
| 1-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-4-yl-trimethylammonium chloride . HCl (CAT1H) | Enzo Life Sciences | ALX-430-131-M250 | |
| Heparin | Sagent Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Diphenyliodonium chloride | Sigma Aldrich | 43088 | |
| Deferoxamin mesylate salt | Sigma Aldrich | D9533-1G | |
| Critoseal | Leica | 39215003 | |
| BRAND disposable BLAUBRAND micropipettes, intraMark | Sigma Aldrich | 708733 | Capillaries |
| PTFE FRACTIONAL FLUOROPOLYMER TUBING 3/16” OD x 1/8” ID |
NORELL | 1598774A | Teflon tubing |
| SILICONE RUBBER STOPPERS FOR NMR SAMPLE TUBES FOR THIN WALL TUBES HAVING AN OD OF 4mm-5mm (3.2mm TO 4.2mm ID) TS-4-5-SR | NORELL | 94987 | |
| EMXnano Bench-Top EPR spectrometer | Bruker BioSpin GmbH | E7004002 | |
| EMX NANO TISSUE CELL | Bruker BioSpin GmbH | E7004542 |
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