Summary

Ensayo de co-inmunoprecipitación para el estudio de las interacciones funcionales entre los receptores y enzimas

Published: September 28, 2018
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo de co-inmunoprecipitación y un ensayo de actividad enzimática en el grano al mismo tiempo estudiar la contribución de los dominios de la proteína específica de los receptores de la membrana plasmática para reclutamiento de la enzima y la actividad enzimática.

Abstract

Asociado a receptor de enzimas son los principales mediadores de la activación celular. Estas enzimas son reguladas, al menos en parte, por interacciones físicas con la cola citoplasmática de los receptores. Las interacciones a menudo se producen a través de dominios específicos de la proteína y resultan en la activación de las enzimas. Existen varios métodos para estudiar interacciones entre proteínas. Co-inmunoprecipitación se utiliza habitualmente para estudiar los dominios que se requieren para las interacciones proteína-proteína, hay no hay ensayos documento la contribución de los dominios específicos a la actividad de las enzimas reclutadas al mismo tiempo. Por consiguiente, el método descrito aquí combina co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad enzimática en el grano para la evaluación simultánea de las interacciones entre las proteínas y la activación enzimática asociada. El objetivo de este protocolo es identificar los dominios que son esenciales para las interacciones físicas entre una proteína y enzima y los dominios que son obligatorios para la completa activación de la enzima. Se demuestra la importancia de este ensayo, como cierto receptor dominios proteicos contribuyen a la Unión de la enzima a la cola citoplasmática del receptor, mientras que otros dominios son necesarias para regular la función de la misma enzima.

Introduction

Receptores catalíticos y cinasas de tirosina de receptores son proteínas transmembranales en la que la Unión de un ligando extracelular provoca actividad enzimática en el lado intracelular1. Algunos receptores poseen receptores y funciones enzimáticas, mientras que otros reclutan las enzimas específicas como las quinasas y fosfatasas que sus colas citoplásmicas. Contratación de una enzima a la cola del receptor y la acción catalítica de esta enzima son dos procesos separados que no siempre están regulados por la misma proteína dominios2. Por desgracia, hay no hay herramientas específicas para evaluar la interacción y la actividad enzimática al mismo tiempo. El ensayo funcional co-inmunoprecipitación se describe aquí es un método útil para disecar la contratación de una enzima a la cola de un receptor de su activación. Este ensayo utiliza inmunoprecipitación de receptores etiquetados granos recubiertos de anticuerpos. Posteriormente, un ensayo de actividad enzimática y la mancha blanca /negra occidental análisis en granos se llevan a cabo. El objetivo general de este método es descubrir qué dominios de proteína son necesarios para las interacciones entre los receptores y enzimas (determinadas por análisis de western blot) y qué dominios son obligatorios para la completa activación de las enzimas (medido por el cordón ensayo de actividad enzimática). Es importante desarrollar herramientas para el estudio de las funciones separadas de enzimas asociado a receptor debido a su participación en la patogenia de enfermedades humanas. Por otra parte, la mayor comprensión de los mecanismos de acción de estas proteínas puede ayudar el diseño de nuevas intervenciones terapéuticas.

Muerte programada-1 (PD-1) es un receptor inhibitorio en la superficie de las células de T y es necesaria para limitar el excesivo T cell responses. En los últimos años, se han implicado anticuerpos anti-PD-1 en el tratamiento de múltiples tumores malignos1,2. PD-1 ligadura refrena numerosas funciones de la célula de T, incluyendo la proliferación, adhesión y secreción de varias citoquinas3,4,5. PD-1 se localiza en la sinapsis inmunológica, la interfaz entre las células T y células presentadoras de antígeno6, donde colocalizes con el receptor de células T (TCR)7. Posteriormente, la tirosina fosfatasa SHP2 [homología Src 2 (SH2) dominio que contiene tirosina fosfatasa 2] es reclutado a la cola citoplasmática de PD-1, conduce a la desfosforilación de residuos claves de tirosina dentro el complejo TCR y su asociado proximal señalización de moléculas3,4,5,8,9. La cola citoplasmática de PD-1 contiene dos motivos de tirosina, un immunoreceptor basados en tirosina inhibidor adorno (ITIM) y un immunoreceptor tyrosine interruptor basado en motif (ITSM)10. Ambos motivos son fosforiladas en PD-1 ligadura9,10. Estudios de mutagénesis han revelado un papel primordial para el ITSM en el reclutamiento, a diferencia de ITIM, cuyo papel en la señalización de PD-1 y la función no está clara de SHP24.

SHP2 adopta sea un cerrado (doblado), inhibió la conformación o abierto (extendido), conformación activa11. La contribución de cada dominio de la cola de PD-1 SHP2 vinculante o activación aún no se ha aclarado. Para responder a esta pregunta, hemos desarrollado un análisis que permite la prueba paralela del reclutamiento de SHP2 a la cola de PD-1 y su actividad12. Emplean co-inmunoprecipitación y un análisis de la actividad de fosfatasa en grano para probar la interacción y la actividad enzimática en paralelo. Usando este análisis, nos muestran que el ITSM de PD-1 es suficiente para reclutar SHP2 a la cola de PD-1, mientras que el ITIM de PD-1 se necesita ampliar y activar la enzima.

Existen muchos receptores que tienen varios dominios adyacentes en su cola citoplasmática. El análisis funcional co-inmunoprecipitación puede descubrir el papel de los dominios específicos que son necesarios para el reclutamiento de la proteína o la activación enzimática.

Protocol

1. transfección de células La semilla células HEK 293T en doce placas de 10 cm (5 x 106 células por placa) el día antes de transfección (figura 1). Realizar el conteo de células usando un hemocitómetro. Para cada placa, use 10 mL de DMEM suplementado con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina. Incube las células a 37 ° C en 5% CO2. Una vez que las células son 80-90% confluente, transfectar 5 placas HEK 293T utilizando un reactivo …

Representative Results

Mientras se establece la contribución de la ITSM de PD-1 enlace de SHP2, el papel de ITIM de PD-1 es menos claro. Porque SHP2 tiene dos dominios SH2 que se pueden unir a dos phosphotyrosines secuenciales de PD-1 (a una tirosina en el ITSM) y otra en el ITIM, presumimos que el ITSM de PD-1 anclas SHP2 PD-1, mientras que el ITIM de PD-1 facilita la actividad de SHP2 estabilizando su Abra estado conformacional11,14. Para probar esto…

Discussion

Interacciones receptor-enzima están cruciales para la señalización intracelular. Muchas enzimas son reclutadas a los receptores a través de dominios SH2 a tirosinas fosforiladas que decoran las colas de los mismos receptores. Sin embargo, enzimas se doblan a menudo en conformaciones inactivos cerrados, y la activación requiere un cambio conformacional11 que puede estar mediado por otros dominios del receptor del mismo. El ensayo descrito aquí medidas de las interacciones entre receptores y e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH 1R01AI125640-01 y la Fundación de investigación de reumatología.

Materials

PBS Lonza 17-516F Phosphate Buffered Saline
Microcentrifuge Eppendorf 5424-R 1.5 ml
Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS Denville FB5001-H Fetal bovine serum
Penicillin / Streptomycin Fisher BP295950
DMEM high glucose without L-glutamine Lonza BE12-614F
SuperFect Transfection Reagent Qiagen 301305
Anti-SHP2 Santa Cruz SC-280
Anti–GFP-agarose MBL D153-8
Anti-GFP Roche 118144600
Anti-Actin Santa Cruz SC-1616
HEK-293 cells ATCC CRL-1573
Orthovanadate Sigma S6508
H2O2 Sigma 216763 30%
Protease inhibitor cocktail Roche 11836170001 EDTA-free
Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) Invitrogen LC2676 Modified Laemmli buffer
4-20% Tris-Glycine Mini Gels Invitrogen XP04205BOX 15-well
Nitrocellulose membranes General Electric 10600004
NaCl Sigma S7653 Sodium chloride
HEPES Gibco 15630080 N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid
DTT Invitrogen D1532 Dithiothreitol
pNPP Sigma 20-106 p-Nitrophenyl Phosphate
NaOH Sigma S8045 Sodium hydroxide
BCA Fisher 23225 Bi Cinchoninic Acid assay

References

  1. Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors. Molecular Cancer. 17 (1), (2018).
  2. Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex. Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).
  3. Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).
  4. Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation. The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).
  5. Patsoukis, N., et al. Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation. Science Signaling. 5 (230), 46 (2012).
  6. Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).
  7. Yokosuka, T., et al. Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2. The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).
  8. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
  9. Sheppard, K. A., et al. PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta. FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).
  10. Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).
  11. Sun, J., et al. Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2. Nature Communications. 4, 2037 (2013).
  12. Peled, M., et al. Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).
  13. Jang, S. H., et al. A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage. Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).
  14. Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains. The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).
  15. McAvoy, T., Nairn, A. C. Serine/threonine protein phosphatase assays. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
  16. Shlapatska, L. M., et al. CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A. The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).

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Cite This Article
Peled, M., Strazza, M., Mor, A. Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes. J. Vis. Exp. (139), e58433, doi:10.3791/58433 (2018).

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