Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per studiare simultaneamente il contributo di domini proteici specifici dei recettori di membrana plasmatica sia reclutamento degli enzimi e l’attività dell’enzima.
Abstract
Associata al recettore gli enzimi sono i principali mediatori di attivazione cellulare. Questi enzimi sono regolati, almeno in parte, da interazioni fisiche con le code citoplasmatiche dei recettori. Le interazioni si verificano attraverso domini proteici specifici spesso e provocare l’attivazione degli enzimi. Ci sono diversi metodi per studiare le interazioni tra proteine. Mentre co-immunoprecipitazione è comunemente utilizzato per lo studio di domini che sono necessari per le interazioni proteina-proteina, non ci sono nessun test che documentano il contributo di domini specifici all’attività degli enzimi reclutati allo stesso tempo. Di conseguenza, il metodo qui descritto combina co-immunoprecipitazione e un saggio di attività enzimatica sul tallone per valutazione simultanea delle interazioni tra proteine e attivazione enzimatica. L’obiettivo del presente protocollo è quello di identificare i domini che sono critici per interazioni fisiche tra una proteina ed enzima e i domini che sono obbligatori per completare l’attivazione dell’enzima. L’importanza di questo test è dimostrata, come determinato ricevitore domini proteici contribuiscono all’associazione dell’enzima per la coda citoplasmatica del recettore, mentre altri domini sono necessari per regolare la funzione dell’enzima stesso.
Introduction
Recettori catalitici e recettori tirosin chinasici sono proteine transmembrana, in cui il legame di un ligando extracellulare causa attività enzimatica sul lato intracellulare1. Alcuni recettori possiedono recettori sia funzioni enzimatiche, mentre gli altri recluta enzimi specifici come chinasi e fosfatasi a loro code citoplasmatiche. Assunzione di un enzima alla coda del recettore e la conseguente azione catalitica di questo enzima sono due processi separati che non sono sempre disciplinati dalla stessa proteina domini2. Purtroppo, non ci sono nessun strumenti specifici per valutare l’interazione e l’attività enzimatica simultaneamente. L’analisi di co-immunoprecipitazione funzionale descritto qui è un metodo utile per sezionare il reclutamento di un enzima per la coda di un recettore dalla sua attivazione. Questo test utilizza immunoprecipitazione dei recettori contrassegnati da perline rivestite con anticorpo. Successivamente, vengono eseguite un’analisi di attività enzimatica e l’analisi western blot su perline. L’obiettivo generale di questo metodo è quello di scoprire quali domini di proteine sono necessari per le interazioni tra recettori e gli enzimi (valutati mediante analisi western blot) e quali domini sono obbligatori per completare l’attivazione degli enzimi (misurato con il tallone analisi di attività enzimatica). È significativo a sviluppare strumenti per studiare le funzioni separate di enzimi associata al recettore a causa del loro coinvolgimento nella patogenesi delle malattie umane. Inoltre, l’ulteriore comprensione dei meccanismi di azione di queste proteine può aiutare la progettazione di nuovi interventi terapeutici.
Morte programmata-1 (PD-1) è un recettore inibitorio sulla superficie delle cellule T ed è necessaria per limitare le risposte delle cellule T eccessivo. Negli ultimi anni, gli anticorpi anti-PD-1 sono stati implicati nel trattamento di tumori maligni multipli1,2. PD-1 legatura trattiene numerose funzioni a cellula T, tra cui la proliferazione, l’adesione e la secrezione di più citochine3,4,5. PD-1 è localizzato alla sinapsi immunologica, l’interfaccia tra le cellule T e cellule presentanti l’antigene6, dove esso colocalizza con il recettore delle cellule T (TCR)7. Successivamente, la tirosina fosfatasi SHP2 [Src homology 2 (SH2) dominio contenente tirosina fosfatasi 2] viene reclutato per la coda citoplasmatica di PD-1, che conduce alla defosforilazione di residui di tirosina chiave all’interno del complesso TCR e suoi associati prossimale segnalazione molecole3,4,5,8,9. La coda citoplasmatica di PD-1 contiene due motivi di tirosina, un immunorecettore basati su tirosina inibitori motivo (ITIM) e un immunorecettore tirosina motivo basato-interruttore (ITSM)10. Entrambi motivi vengono fosforilate su PD-1 legatura9,10. Studi di mutagenesi hanno rivelato un ruolo primario per l’ITSM SHP2 reclutamento, in contrasto con il ITIM, il cui ruolo nella segnalazione di PD-1 e la funzione non è chiaro4.
SHP2 adotta sia un chiuso (piegato), ha inibito la conformazione o un open (esteso), conformazione attiva11. Il contributo di ciascun dominio di coda di PD-1 SHP2 associazione o l’attivazione non è stata ancora chiarito. Per rispondere a questa domanda, abbiamo sviluppato un test che consente il test parallelo del reclutamento di SHP2 alla coda del PD-1 e sua attività12. Abbiamo impiegato co-immunoprecipitazione e un’analisi di attività della fosfatasi sul tallone per testare l’interazione e l’attività enzimatica in parallelo. Usando questa analisi, indichiamo che l’ITSM di PD-1 è sufficiente per reclutare SHP2 alla coda del PD-1, mentre il ITIM di PD-1 è necessario per estendere completamente e attivare l’enzima.
Ci sono molti recettori che hanno diversi domini adiacenti in loro code citoplasmatiche. Il test funzionale di co-immunoprecipitazione può scoprire il ruolo di specifici domini che sono necessari per l’attivazione enzimatica o di assunzione di proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Interazioni del ricevitore-enzima sono cruciali per segnalazione intracellulare. Molti enzimi sono reclutati ai ricevitori attraverso domini SH2 associazione a tirosine fosforilate che decorano le code degli stessi recettori. Tuttavia, gli enzimi sono spesso piegati in conformazioni inattive chiuse e attivazione richiede un cambiamento conformazionale11 che può essere mediato da altri domini del recettore stesso. Il test descritto qui misure le interazioni tra recettori e gli enzimi come pure l’a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato da sovvenzioni NIH 1R01AI125640-01 e la reumatologia Research Foundation.
Materials
| PBS | Lonza | 17-516F | Phosphate Buffered Saline |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424-R | 1.5 ml |
| Trypsin-EDTA (0.25%) Phenol Red | Gibco | 25200114 | |
| Heat Inactivated FBS | Denville | FB5001-H | Fetal bovine serum |
| Penicillin / Streptomycin | Fisher | BP295950 | |
| DMEM high glucose without L-glutamine | Lonza | BE12-614F | |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | |
| Anti-SHP2 | Santa Cruz | SC-280 | |
| Anti–GFP-agarose | MBL | D153-8 | |
| Anti-GFP | Roche | 118144600 | |
| Anti-Actin | Santa Cruz | SC-1616 | |
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| H2O2 | Sigma | 216763 | 30% |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | EDTA-free |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC2676 | Modified Laemmli buffer |
| 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Invitrogen | XP04205BOX | 15-well |
| Nitrocellulose membranes | General Electric | 10600004 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Sodium chloride |
| HEPES | Gibco | 15630080 | N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid |
| DTT | Invitrogen | D1532 | Dithiothreitol |
| pNPP | Sigma | 20-106 | p-Nitrophenyl Phosphate |
| NaOH | Sigma | S8045 | Sodium hydroxide |
| BCA | Fisher | 23225 | Bi Cinchoninic Acid assay |
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