Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek
Summary
Burada Drosophila Yetişkin bacaklar fiksasyon, montaj, görüntüleme ve sonrası görüntüleme adımları floresan bir protein ile aksonal hedefleme görselleştirmek için bir protokol açıklayın.
Abstract
Nöronal belirtimi çalışmalarına çoğunluğu Cgibi genetik ve fizyolojik uysal modellerinde yapılmıştır. elegans, Drosophila larva ve balık, hangi tarama ya da yüzme) (gibi undulatory hareketleri hareket onların birincil modu olarak meşgul. Ancak, bireysel motor nöron (MN) belirtimi anlayış daha sofistike — en az hastalık tedavileri bilgilendirme açısından — daha karmaşık ek parça tabanlı hareket şemaları modelleri eşit uysal bir sistemi talepleri omurgalı. Bu modelde kolayca ayırt edici bacak MNs (yaklaşık 50 ans bacak ücret) az sayıda tayini eğitim almak mümkündür yürüyüş sorumlu yetişkin Drosophila lokomotor sistem bu ölçütlerin tümünü kolaylıkla, her iki geniş bir uygun kullanma dizi genetik araçları güçlü ve bir ek parça tabanlı hareket düzeni fizyolojik bağlamında. Burada yetişkin bir sinek bacak kas innervasyon görselleştirmek için bir protokol açıklayın.
Introduction
Omurgalı bacak gibi Drosophila yetişkin bacak parça halinde düzenlenmiştir. Her sinek bacak her biri birden çok kas lifleri1,2oluşur 14 Kas içerir. Yetişkin bacak MNs hücre organlarının T1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 ve T3 (metathoracic) gangliyon ventral sinir kablosu (VNC), bir yapısal omurgalı spinal kord (Şekil 1) benzer her tarafında yer alır. Hangi hedef Ipsilateral bacak (coxa, trochanter, femur ve tibia) dört segmentlerinde (Şekil 1)3kas her gangliyon içinde yaklaşık 50 ans vardır. Önemlisi, her bireysel yetişkin bacak MN hayvanlar3,4arasında son derece kökleşmiş benzersiz bir morfolojik kimliğe sahiptir. Bu benzersiz MNs sırasında larva aşamaları3,4bacak MNs üreten neuroblasts (NBs) adı verilen 11 kök hücrelerden türetilir. Bütün larva aşamaları sonunda olgunlaşmamış postmitotic MNs metamorfoz sırasında onların belirli dendritik arbors ve kendi benzersiz morfoloji3,4tanımlamak aksonal terminal hedefleri elde etmek için ayırt etmek. Daha önce bir birleşimsel kodu transkripsiyon faktörlerinin (TFs) her Drosophila yetişkin bacak MN5benzersiz morfoloji belirtir hipotez test ettik. Bir model olarak, soy B, postmitotic yetişkin bacağından MNs ifade TFs Kombinatorik kurallarına onların bireysel türleri morfoloji dikte gösterdi ve yedi MNs dışarı üretir 11 NB soy kullandık. MNs TF kodunu REPROGRAMING tarafından biz tahmin edilebilir bir şekilde MN türleri morfoloji geçmek mümkün olmuştur. Bunlar TFs diyoruz: mTFs (morfolojik TFs)5.
Yetişkin MNs morfolojik analiz en zorlu kısmı kalın ve auto-floresan kütikül yüksek çözünürlüklü aracılığıyla aksonlar görselleştirmek etmektir. Biz genellikle aksonlar MNs içinde DVglut-Gal4gibi bir ikili ifade sistemi ile ifade edilen bir membran öğesini GFP ile etiket /UAS-mCD8::GFP veya DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, DVglut güçlü bir sürücü olarak ifade nerede motoneurons6. Bu araçlar repressible işaretçisi (MARCM)7, CIS-MARCM8veya MARCMbow5ile mozaik çözümlemesi gibi klonal diğer tekniklerle birleştirerek, fenotipik analiz yapma MNs altgrupları GFP ifade kısıtlayabilirsiniz akson daha kolay. Belirli sorunları (1) Yetişkin bacak iç yapıları fiksasyonu gibi yetişkin Drosophila bacak iç ele alarak bacak MN aksonal morfoloji görüntüleme ve sonraki 3D yeniden inşası için sağlam tutmak için bir protokol üretilip axon morfoloji, endojen floresan ifade ve bacak kas, etkileyen bir coverslip altında ve görüntüleme ve (3) görüntü işleme manikür elde etmek için uygun yönde genel yapıyı korumak için bacak (2) montaj arka plan olarak aksonal floresan sinyal. Bu iletişim kuralı MN aksonlar floresan ifade tespiti için ayrıntılı iken, eklembacaklılar bacak neuromusculature diğer bileşenleri görselleştirmek için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yetişkin Drosophila ve diğer eklembacaklılar, birçok koyu pigmentler içerir, manikür yapıları kendi vücudunun içinde görüntülemek için önemli bir engeldir. Buna ek olarak, bu güçlü kötü fiksasyon tarafından yapılan otomatik floresan var. Bu iki özellik floresan boyalar veya moleküller bir exoskeleton hayvanlarla, gövdesinde gözlemleri için çok sorunlu.
Bu tarif var ve laboratuarda rutin olarak kullanan yordamı temiz ve detaylı görüntüleri axon yörüngeler ve y…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Robert Renard sinek gıda orta hazırlamak için teşekkür ederim. Bu iş R.S.M. için bir NIH hibe NS070644 tarafından desteklenen ve finansman ALS Derneği (#256), FRM (#AJE20170537445) ve CD’ye atıp Avenir Program J.E. oldu
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
