Visualizar Drosophila pierna axones de la neurona de Motor a través de la cutícula del adulto
Summary
Aquí se describe un protocolo para visualizar la orientación axonal con una proteína fluorescente en piernas de adultos del Drosophila por fijación, montaje, proyección de imagen y la proyección de imagen de pasos.
Abstract
La mayoría del trabajo sobre la especificación neuronal se ha realizado en modelos genético y fisiológico manejables como C. elegans, Drosophila larvas y peces, que participan en movimientos ondulatorios (como gatear o natación) como su principal modo de locomoción. Sin embargo, una más sofisticación comprensión de la especificación de cada motoneurona (MN), por lo menos en cuanto a informar a terapias de la enfermedad, exige un sistema igualmente manejable que mejor modela los sistemas complejos basados en apéndices de locomoción de vertebrados. El adulto Drosophila aparato locomotor encargado de caminar cumple todos estos criterios con facilidad, ya que en este modelo es posible estudiar la especificación de un número pequeño de piernas fácilmente distinguido MNs (aproximadamente 50 minutos por pierna) usan una gran matriz de herramientas genéticas de gran alcance y en el contexto fisiológico de un sistema de locomoción basado en el apéndice. Aquí se describe un protocolo para visualizar la inervación del músculo de la pierna en una mosca adulta.
Introduction
Como la extremidad vertebrada, la pierna de adultos del Drosophila está organizada en segmentos. Cada pata de mosca contiene 14 músculos, cada uno de los cuales consta de múltiples fibras musculares1,2. Los cuerpos celulares de los MNs de pierna adulto se encuentran en la T1 (protorácico), T2 (mesotorácicos) y T3 (metathoracic) ganglios a cada lado de la cuerda ventral del nervio (VNC), un estructural análoga a la médula espinal vertebrada (figura 1). Hay aproximadamente 50 minutos en cada uno de los ganglios, cuyo objetivo los músculos en cuatro segmentos de la pierna ipsolateral (coxa, trocánter, fémur y tibia) (figura 1)3. Lo importante, cada pierna adulto individual MN tiene una única identidad morfológica que es altamente estereotipada entre animales3,4. Todos estos MNs únicas derivan de 11 células madre, llamadas neuroblastos (NBs) produciendo MNs de la pierna durante los estadios larvarios3,4. Al final de las etapas larvales todos los MNs postmitotic inmaduros diferencian durante la metamorfosis al adquirir sus árboles dendríticos específicos y objetivos terminal axonales que definen su morfología única3,4. Previamente hemos probado la hipótesis de que un código de combinatorio de factores de transcripción (TFs) especifica la morfología única de cada pata de adultos del Drosophila MN5. Como modelo, se utilizó el linaje B, uno de los 11 linajes NB que produce siete de los MNs y demostró que un código combinatorio de TFs en pierna adulto postmitotic MNs dicta sus morfologías individuales. Por reprogramación del código TF de MNs hemos podido cambiar morfologías MN de manera predecible. Llamamos estos TFs: SMN (morfológicos TFs)5.
Una de las partes más difíciles de los análisis morfológicos de adultos MNs es visualizar los axones a través de una cutícula gruesa y auto-fluorescente con alta resolución. Generalmente la etiqueta de axones con un GFP etiquetadas de membrana que se expresa en el MNs con un sistema binario de la expresión, como DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP o DVglut QF / QUAS mCD8::GFP, donde DVglut es un fuerte conductor expresado en motoneurons6. Al combinar estas herramientas con otras técnicas clonales tales como análisis de mosaico con un marcador repressible (MARCM)7, MARCM cis8o MARCMbow5, podemos restringir la expresión de GFP en subpoblaciones de MNs haciendo el análisis fenotípico de axones más fácil. Hemos generado un protocolo para mantener la pierna morfología axonal MN intacto para la imagen y posterior reconstrucción 3D abordando cuestiones intrínsecas a la pierna de Drosophila adulta tales como (1) fijación de las estructuras internas de la pierna adulto sin afectar la morfología de axón, endógena expresión fluorescente y musculatura de la pierna, (2) montaje de la pierna para preservar la estructura general bajo un cubreobjetos y con la orientación adecuada para la proyección de imagen y (3) de procesamiento de imágenes para obtener la cutícula fondo como señal fluorescente axonal. Aunque este protocolo ha sido detallada para la detección de la expresión fluorescente en axones MN, puede aplicarse para visualizar otros componentes del neuromusculature de la pierna en los artrópodos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cutícula de la Drosophila adulta y de otros artrópodos, que contiene muchos pigmentos oscuros, es un obstáculo importante para la visualización de estructuras dentro de su cuerpo. Además, es fuertemente auto fluorescente que es hecho peor por la fijación. Estas dos características son muy problemáticas para las observaciones de colorantes fluorescentes o moléculas dentro del cuerpo de los animales con un exoesqueleto.
El procedimiento que hemos descrito y que habitualmente utilizam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Robert Renard para preparar medio mosca alimentos. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH NS070644 a la R.S.M. y financiación de la Asociación de ELA (#256), FRM (#AJE20170537445) y programa de ATIP-Avenir a J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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