Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto
Summary
Aqui descrevemos um protocolo para visualizar o direcionamento axonal com uma proteína fluorescente em adultas pernas de drosófila por fixação, montagem, imagem e pós-imagem passos.
Abstract
A maioria dos trabalhos na especificação neuronal procedeu-se em genética e fisiologicamente tractable modelos como o C. elegans, Drosophila larvas e peixes, que todos se envolver em movimentos ondulatória (como rastreamento ou natação) como seu principal modo de locomoção. No entanto, uma forma mais sofisticada compreensão da especificação individual do neurônio motor (MN) — pelo menos em termos de informar terapias doença — exige um sistema igualmente tractable que modela melhor os esquemas complexos baseados em apêndice locomoção de vertebrados. O sistema locomotor Drosophila adulto responsável por andar reúne-se todos esses critérios com facilidade, já que neste modelo é possível estudar a especificação de um número pequeno de perna facilmente distinto MNs (aproximadamente 50 MNs por perna) ambos usando um vasto matriz de poderosas ferramentas de genéticas e no contexto de um sistema de locomoção baseada em apêndice fisiológico. Aqui descrevemos um protocolo para visualizar a inervação do músculo de perna em uma mosca adulta.
Introduction
Como o membro de vertebrados, a perna de Drosophila adulta é organizada em segmentos. Cada perna de mosca contém 14 músculos, cada um dos quais compreende várias fibras musculares1,2. Os corpos celulares de MNs a perna adultos estão localizados no T1 (prothoracic), T2 (mesothoracic) e T3 (metathoracic) gânglios em cada lado do cabo ventral do nervo (VNC), uma estrutura análoga à medula espinhal vertebrada (Figura 1). Existem aproximadamente 50 MNs em cada gânglio, cujo objectivo músculos em quatro segmentos da perna ipsilateral (coxa, trocanter, fêmur e tíbia) (Figura 1)3. Importante, cada perna adulta individual MN tem uma identidade única e morfológica que é altamente estereotipada entre animais3,4. Todas essas MNs exclusivos são derivados de 11 células-tronco, chamadas neuroblastos (NBs) produzindo perna MNs durante os estágios larvais de3,4. No final da fase larval todos os imaturos MNs postmitotic diferenciam durante a metamorfose para adquirir seus mandris dendríticas específicos e alvos terminais axonal que definem sua morfologia original3,4. Anteriormente, nós testamos a hipótese de que um código combinatório de factores de transcrição (TFs) especifica a morfologia original de cada perna adulta Drosophila MN5. Como modelo, utilizamos a linhagem B, uma das 11 NB linhagens que produz sete fora os MNs e demonstrou que um código combinatório do TFs expressa na perna adulta postmitotic MNs dita suas morfologias individuais. Por reprograming o código TF de MNs, fomos capazes de alternar as morfologias MN de forma previsível. Chamamos-lhes TFs: MTF (TFs morfológico)5.
Uma das partes mais desafiantes das análises morfológicas dos adultos MNs é Visualizar os axônios através de uma cutícula espessa e autofluorescente com alta resolução. Nós geralmente rotulamos axônios com uma membrana-tag GFP que se expressa no MNs com um sistema de expressão binário, como DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP ou DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, onde DVglut é um forte expressado em motoneurônios6. Combinando estas ferramentas com outras técnicas clonais, como análise de mosaico com um marcador repressible (MARCM)7, cis-MARCM8ou MARCMbow5, nós pode restringir a expressão de GFP de subpopulações de MNs, fazendo a análise fenotípica de axônios mais fácil. Geramos um protocolo a fim de manter a perna morfologia axonal MN intacta para reconstrução 3D de imagens e subsequente, abordando questões específicas intrínsecos na perna de Drosophila adulto tais como (1) fixação das estruturas internas da perna adulta sem afetar a morfologia do axônio, expressão fluorescente endógena e musculatura da perna, (2) montagem da perna para preservar a estrutura geral sob uma lamela e na orientação adequada para processamento para obter a cutícula de imagem da imagem latente e (3) fundo, bem como sinal fluorescente axonal. Embora este protocolo tem sido detalhado para a detecção de expressão fluorescente em axônios MN, pode ser aplicado para visualizar outros componentes da perna neuromusculature em artrópodes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A cutícula de Drosophila adulto e de outros artrópodes, que contém muitos pigmentos escuros, é um grande obstáculo para a visualização de estruturas dentro do seu corpo. Além disso, é fortemente fluorescente auto que é agravada pela fixação. Estas duas características são muito problemáticas para observações de corantes fluorescentes ou moléculas dentro do corpo dos animais com um exoesqueleto.
O procedimento que descrevemos e que usamos rotineiramente no laboratório produz …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Robert Renard para preparar meio comida de mosca. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de NIH NS070644 para R.S.M e financiamento da ALS Association (#256), FRM (#AJE20170537445) e programa de ATIP-Avenir de J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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