Visualizzare Drosophila gamba del neurone di motore assoni attraverso la cuticola adulto
Summary
Qui descriviamo un protocollo per visualizzare il targeting assonale con una proteina fluorescente in gambe adulte della drosofila di fissazione, di montaggio, di imaging e passaggi di post-formazione immagine.
Abstract
La maggior parte del lavoro sulla specifica neuronale è stata effettuata nei modelli geneticamente e fisiologicamente trattabili come C. elegans, larve di Drosophila e pesce, che tutti impegnarsi in movimenti ondulatorio (come la ricerca per indicizzazione o nuotare) come loro principale mezzo di locomozione. Tuttavia, una più sofisticata comprensione della specifica individuale del neurone di motore (MN) — almeno in termini di informazione terapie malattia — richiede un sistema altrettanto docile che modella meglio gli schemi complessi basati su appendice locomozione dei vertebrati. Apparato locomotore Drosophila adulto incaricato a piedi soddisfa tutti questi criteri con facilità, dato che questo modello è possibile studiare la specifica di un piccolo numero di gamba facilmente distinto MNs (circa 50 MNs per gamba) sia utilizzando una vasta matrice di potenti strumenti di genetiche e nel contesto di un regime basato su appendice locomozione fisiologico. Qui descriviamo un protocollo per visualizzare l’innervazione muscolare gamba in una mosca adulta.
Introduction
Come l’arto dei vertebrati, la gamba di adulto di Drosophila è organizzata in segmenti. Ogni gamba Vola contiene 14 muscoli, ognuno dei quali comprende più fibre muscolari1,2. I corpi cellulari dei MNs gamba adulto si trovano nel T1 (protoraciche), T2 (mesotoraciche) e T3 (metatoraciche) gangli su ogni lato del midollo ventrale del nervo (VNC), una strutturale analoga al midollo spinale dei vertebrati (Figura 1). Ci sono circa 50 MNs in ogni gangli, quale destinazione muscoli in quattro segmenti della gamba ipsilateral (coxa, trocantere, femore e tibia) (Figura 1)3. Soprattutto, ogni gamba adulto singolo MN ha una propria identità morfologica che è altamente stereotipata tra animali3,4. Tutti questi unici MNs sono derivati da cellule staminali 11, chiamate neuroblasti (NBs) producendo gamba MNs durante gli stadi larvali3,4. Alla fine di tutti gli stadi larvali l’immaturo MNs postmitotic differenziare durante la metamorfosi di acquisire loro specifici supporti conici dendritiche e axonal terminali obiettivi che definiscono la loro morfologia unica3,4. In precedenza abbiamo verificato l’ipotesi che un codice combinatorio di fattori di trascrizione (TFs) specifica la morfologia unica di ciascuna gamba adulto di Drosophila MN5. Come modello, abbiamo usato il lignaggio B, uno dei lignaggi NB 11 che produce sette sulla MNs e ha dimostrato che un codice combinatorio di TFs espressa in gamba adulto postmitotic MNs impone loro morfologie individuali. Di riprogrammazione del codice TF di MNs siamo stati in grado di passare morfologie di MN in modo prevedibile. Chiamiamo questi TFs: sistemi multilaterali di negoziazione (morfologiche TFs)5.
Una delle parti più impegnative delle analisi morfologiche di adulto MNs è visualizzare gli assoni attraverso una cuticola spessa e auto-fluorescente ad alta risoluzione. Etichettiamo solitamente gli assoni con un membrana-tagged GFP che si esprime in MNs con un sistema di espressione binaria, ad esempio DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP o DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, dove DVglut è un pilota forte espresso in motoneuroni6. Combinando questi strumenti con altre tecniche clonale come analisi di mosaico con un marcatore reprensibile (MARCM)7, cis-MARCM8o MARCMbow5, possiamo limitare l’espressione di GFP alle sottopopolazioni di MNs rendendo l’analisi fenotipica degli assoni più facili. Abbiamo generato un protocollo al fine di mantenere la gamba morfologia assonale MN intatto per imaging e successiva ricostruzione 3D di questioni specifiche intrinseche alla gamba della drosofila adulta come (1) fissazione delle strutture interne della gamba adulta senza alterare la morfologia dell’assone, espressione endogena di fluorescente e piedino la muscolatura, (2) montaggio del piedino per preservare la struttura complessiva sotto un vetrino coprioggetto e nell’orientamento appropriato per imaging e (3) elaborazione delle immagini per ottenere la cuticola Priorità bassa come pure axonal segnale fluorescente. Mentre questo protocollo è stato dettagliato per la rilevazione dell’espressione fluorescente in assoni MN, può essere applicato per visualizzare altri componenti di gamba neuromusculature in artropodi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cuticola della drosofila adulta e di altri artropodi, che contiene molti pigmenti scuri, è dei principali ostacoli per la visualizzazione di strutture all’interno del loro corpo. In aggiunta, è fortemente auto fluorescente che è aggravata dalla fissazione. Queste due caratteristiche sono molto problematiche per le osservazioni di coloranti fluorescenti o molecole all’interno del corpo di animali con un esoscheletro.
La procedura che abbiamo descritto e che utilizziamo ordinariamente in l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Robert Renard per la preparazione di medie di volare. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di NIH NS070644 a r.s.m. e finanziamento dall’ALS Association (n. 256), FRM (#AJE20170537445) e programma ATIP-Avenir a J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
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