דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים
Summary
כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את מיקוד עצב עם חלבון נמכרות ברגליים למבוגרים של זבוב החומץ על ידי קיבוע, הרכבה, הדמיה, ההדמיה שלאחר צעדים.
Abstract
רוב העבודה על המפרט עצביים התבצע במודלים גנטית, מבחינה פיזיולוגית צייתן כמו C. elegans דרוזופילה הזחלים, דגים, אשר כולם עוסקים תנועות undulatory (כמו זחילה או שחייה) כמצב העיקרי שלהם ומכניקה. עם זאת, יותר מתוחכם הבנה של מפרט נוירון מוטורי הפרט (MN) — לפחות מבחינת להודיע טיפולים למחלות — דורש מערכת לא פחות צייתן יותר מודלים מורכבים מבוססי גפה ומכניקה של סכמות חולייתנים. למבוגרים דרוזופילה גינקולוגיות המערכת אחראית על הליכה עונה כל קריטריונים אלה בקלות, שכן במודל זה ניתן ללמוד את המפרט של מספר קטן של הרגל בקלות מכובד MNs (כ 50 MNs לכל הרגל) באמצעות שני עצום מערך של כלים רבי-עוצמה גנטי, בהקשר פיזיולוגיים של מזימת מבוססי גפה ומכניקה. כאן נתאר פרוטוקול להמחיש את העצבוב שריר הרגל ב זבוב למבוגרים.
Introduction
כמו האיבר חוליות, הרגל למבוגרים דרוזופילה מאורגן למקטעים. כל רגל לטוס מכיל 14 השרירים, שכל אחת מהן כוללת סיבי שריר מספר1,2. הגופים תא של הרגל למבוגרים MNs ממוקמים ב (prothoracic) T1, T2 (mesothoracic), ו T3 הגרעינים (metathoracic) בכל צד של חוט עצבי הגחון (VNC), הנדסי מקביל חוליות חוט השדרה (איור 1). ישנם כ- 50 MNs כל הגרעינים, היעד שבו השרירים ארבעה חלקים של הרגל חולשת (coxa תל הירך, עצם הירך, שוקה) (איור 1)3. חשוב, כל רגל מבוגרים בודדים MN יש זהות מורפולוגי ייחודי זה מאוד סטריאוטיפית בין בעלי חיים3,4. כל MNs ייחודיים אלה נגזרים מתאי גזע 11, שנקרא neuroblasts (שהודיעו) בהפקת הרגל MNs במהלך ה3,דרגות זחל4. בסוף כל הזחל MNs postmitotic ילדותי להבדיל במהלך המטמורפוזה לרכוש שלהם ובשבילים דנדריטים ספציפיות ויעדים עצב מסוף המגדירים שלהם3,ייחודי מורפולוגיה4. קודם לכן בדקנו את ההשערה כי קוד קומבינטורית של גורמי שעתוק (TFs) מציינת המבנה הייחודי של כל רגל למבוגרים דרוזופילה MN5. כמודל, השתמשנו השושלת B, לאחד שושלות NB 11, אשר מייצרת שבעה מתוך MNs והפגינו קוד קומבינטורית של TFs הביע ברגל למבוגרים postmitotic MNs מכתיבה מורפולוגיות בודדים שלהם. על ידי reprograming את הקוד TF של MNs היינו מסוגלים להחליף MN מורפולוגיות באופן צפוי. אנחנו קוראים להם שר: mTFs (TFs מורפולוגי)5.
אחד החלקים המאתגרים ביותר של המורפולוגיים של MNs למבוגרים הוא להמחיש את האקסונים דרך הקוטיקולה עבה, auto-פלורסנט עם רזולוציה גבוהה. בדרך כלל מתייגים אקסונים עם GFP מתויג ממברנה מתבטאת MNs עם מערכת בינארית הביטוי, כגון DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP או DVglut-העל / QUAS mCD8::GFP, כאשר DVglut הוא נהג חזק לידי motoneurons6. על ידי שילוב של כלים אלה עם טכניקות טיפול נוספות המשובטים פסיפס ניתוח עם סמן repressible (MARCM)7, cis-MARCM8או MARCMbow5, אנחנו ניתן להגביל את הביטוי GFP כדי subpopulations של MNs ביצוע הניתוח פנוטיפי של אקסונים קל יותר. יש לנו שנוצר פרוטוקול על מנת לשמור על הרגל מורפולוגיה עצב MN ללא פגע עבור שחזור 3D הדמיה ובעקבות שתתייחסי לנושאים ספציפיים מהותי הרגל דרוזופילה למבוגרים כגון קיבוע (1) של המבנים הפנימיים של הרגל למבוגרים מבלי להשפיע על מורפולוגיה האקסון ביטוי פלורסנט אנדוגני, לשריר הרגל, (2) הרכבה של הרגל כדי לשמר את המבנה הכללי תחת של coverslip, את הכיוון המתאים לעיבוד כדי להשיג את הקוטיקולה תמונה הדמיה, ו- (3) ברקע, כמו גם עצב אות ניאון. אמנם יש כבר מפורט פרוטוקול זה איתור פלורסנט ביטוי MN אקסונים, ניתן להחיל אותה לדמיין רכיבים אחרים של הרגל neuromusculature של פרוקי רגליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקוטיקולה של דרוזופילה למבוגרים, של פרוקי רגליים אחרים, אשר מכיל פיגמנטים כהים רבים, זו היא מכשול גדול לצפייה מבנים בתוך הגוף שלהם. בנוסף, מומלץ מאוד פלורסנט אוטומטי אשר נעשה גרוע יותר על ידי קיבוע. שתי תכונות אלה הן בעייתי מאוד עבור תצפיות של צבעי פלורסנט או מולקולות בתוך הגוף של בעלי שלד ח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים רוברט רנארד על הכנת אוכל לטוס בינוני. עבודה זו היה נתמך על ידי מענק NIH NS070644 כדי R.S.M., במימון עמותת ALS (#256), עקרות (#AJE20170537445), ATIP-Avenir תוכנית כדי במקום
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
