Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula
Summary
Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren de axonale richt met een TL proteïne in volwassen benen van Drosophila door fixatie, montage, imaging en na imaging stappen.
Abstract
Het merendeel van de werkzaamheden op de neuronale specificatie is in genetisch en fysiologisch hanteerbare modellen zoals Cuitgevoerd. elegans Drosophila larven en vis, die alle golvend bewegingen (zoals kruipen of zwemmen) deelnemen als hun primaire wijze van voortbewegen. Echter een meer verfijnd begrip van de individuele motor neuron (MN) specificatie — ten minste op het gebied van de voorlichting van ziekte therapieën — vraagt om een even hanteerbare systeem dat beter de motoriek van complexe aanhangsel gebaseerde regelingen van modellen gewervelde dieren. Het volwassen Drosophila bewegingsstelsel belast met wandelen voldoet aan al deze criteria met gemak, aangezien in dit model is het mogelijk om te bestuderen van de specificatie van een klein aantal gemakkelijk DN been MNs (ongeveer 50 MNs per poot) beide met behulp van een enorme matrix van krachtige genetische hulpmiddelen, en in de fysiologische context van een aanhangsel gebaseerde locomotion-regeling. Hier beschrijven we een protocol om te visualiseren het been spier innervatie arm in een volwassen vlieg.
Introduction
Zoals de gewervelde ledematen, is de Drosophila volwassen poot onderverdeeld in segmenten. Elk vliegen been bevat 14 spieren, die bestaat uit meerdere spiervezels1,2. De organen van de cel van de volwassen been MNs bevinden zich in de T1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 en T3 (metathoracic) ganglia aan elke kant van het ventrale zenuw snoer (VNC), een structurele analoog aan het gewervelde ruggenmerg (Figuur 1). Er zijn ongeveer 50 MNs in elke ganglia, welk doel spieren in vier segmenten van de ipsilaterale poot (coxa, trochanter, femur en tibia) (Figuur 1)3. Nog belangrijker is, heeft elke individuele volwassen been MN een unieke morfologische identiteit die is zeer stereotiep tussen dieren3,4. Alle deze unieke MNs zijn afgeleid van de 11 cellen van de stam, genaamd neuroblasten (NBs) been MNs produceren tijdens de larvale stadia3,4. Aan het einde van de larvale stadia van alle onderscheiden de onrijpe postmitotic MNs tijdens de metamorfose hun specifieke dendritische arbors en axonale terminal doelen die bepalen van hun unieke morfologie3,4te verwerven. Eerder testten we de hypothese dat een combinatorische code van transcriptiefactoren (TFs) Hiermee geeft u de unieke morfologie van elk Drosophila volwassen been MN5. Als een model, we gebruikten lineage B, één van de 11 NB lineages die zeven van de MNs produceert en aangetoond dat een combinatorische code van TFs uitgedrukt in postmitotic volwassen been MNs dicteert hun individuele morphologies. Door reprograming van de code van de TF van MNs is ons gelukt om over te schakelen van MN morphologies op een voorspelbare wijze. We noemen deze TFs: MTF’s (morfologische TFs)5.
Een van de meest uitdagende onderdelen van de morfologische analyses van volwassen MNs is het visualiseren van de axonen door middel van een dikke en auto-belichting fluorescerende schubbenlaag met hoge resolutie. We meestal label axonen met een membraan-gelabeld GFP die wordt uitgedrukt in MNs met een binaire expressie systemen, zoals DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP of DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, waar DVglut is een sterke driver uitgedrukt in motoneurons6. Door deze hulpmiddelen te combineren met andere klonen technieken zoals mozaïek analyse met een repressible marker (MARCM)7, cis-MARCM8of MARCMbow5, kunnen we de expressie GFP subpopulaties van MNs maken de fenotypische analyse beperken van axonen gemakkelijker. We hebben een protocol gegenereerd zodat been MN axonale morfologie intact voor beeldvorming en de daaropvolgende 3D reconstructie door het aanpakken van specifieke problemen inherent is aan de volwassen Drosophila been zoals (1) fixatie van de interne structuren van de volwassen poot zonder axon morfologie, endogene fluorescerende expressie, en been spieren, (2) montage van de poot voor het behoud van de algehele structuur onder een dekglaasje aan en in de juiste richting voor beeldvorming, en (3) beeldverwerking te verkrijgen van de epidermis achtergrond evenals axonale fluorescent signaal. Terwijl dit protocol heeft voor het opsporen van fluorescerende expressie in MN axonen zijn gedetailleerd, kan het worden toegepast om te visualiseren van andere onderdelen van been neuromusculature bij geleedpotigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De schubbenlaag van volwassen Drosophila en andere geleedpotigen, waarin vele donkere pigmenten, is een groot obstakel voor het bekijken van de structuren in hun lichaam. Het is bovendien sterk auto TL, die wordt verergerd door fixatie. Deze twee functies zijn zeer problematisch voor waarnemingen van fluorescente kleurstoffen of moleculen in het lichaam van dieren met een exoskelet.
De procedure die we hebben beschreven en die we regelmatig gebruiken in het lab levert schoon en gedetailleerde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Robert Renard voor het opstellen van vliegen voedsel medium. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie NS070644 voor R.S.M. en financiering uit ALS vereniging (#256), FRM (#AJE20170537445) en ATIP-Avenir programma aan J.E.
Materials
| Ethanol absolute | Fisher | E/6550DF/17 | Absolute analytical reagent grade |
| nonionic surfactant detergent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100, for molecular biology |
| Fine forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | Jewelers forceps, Dumont No. 5 |
| Glass multi-well plate | Electron Microscopy Sciences | 71563-01 | 9 cavity Pyrex, 100×85 mm |
| PFA | Thermofisher | 28908 | Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP 229-1 | Glycerol (Molecular Biology) |
| Spacers | Sun Jin Lab Co | IS006 | iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep |
| Square 22×22 mm coverslips | Fisher Scientific | FIS#12-541-B | No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick |
| Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | Vectashield Antifade Mounting Medium |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ silicon/glycerol/water immersion) (420852-9871-000) |
|
| imaging software | Carl Zeiss | ZEN 2011 | |
| 3D-Image software | ThermoFisher Scientific | Amira 6.4 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | ImageJ/FIJI |
References
- Miller, A., Demerec, M. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).
- Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg. Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).
- Baek, M., Mann, R. S. Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).
- Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons. Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).
- Enriquez, J., Mann, R. S. Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).
- Mahr, A., Aberle, H. The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain. Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).
- Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila. Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
- Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map. PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).
