Summary

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

Published: July 30, 2018
doi:

Summary

El protocolo describe una técnica para estudiar la capacidad del primario policlonal T las células humanas para formar sinápticas interfaces con bicapas lipídicas planares. Utilizamos esta técnica para mostrar la capacidad de formación de sinapsis diferencial de las células T humanas principal derivado de los ganglios linfáticos y la sangre periférica.

Abstract

La comprensión actual de la dinámica y características estructurales de interfaces sinápticas del T-cell ha sido determinados en gran medida mediante el uso de bicapas planas basadas en cristal y en vitro-derivada de la célula de T clones o líneas1,2 ,3,4. Cómo estos resultados se aplican a las células de T humanas primarias aisladas de sangre o linfoides tejidos no se conoce, en parte debido a dificultades importantes en la obtención de un número suficiente de células para análisis5. Aquí nos dirigimos a través del desarrollo de una técnica de explotación de diapositivas de flujo multicanal para construir bicapas lipídicas planares conteniendo moléculas de activación y adhesión. La baja altura de las diapositivas de flujo promueve la sedimentación rápida de la célula para sincronizar accesorio celular: bicapa, lo que permite a los investigadores a estudiar la dinámica de la formación sináptica de la interfaz y la cinética de la liberación de los gránulos. Aplicamos este enfoque para analizar la interfaz sináptica de tan sólo 104 105 primaria criopreservados T células aisladas de los ganglios linfáticos (LN) y sangre periférica (PB). Los resultados revelan que la técnica de la bicapa de lípidos planar novela permite el estudio de las propiedades biofísicas de las células T primarias humanas derivadas de la sangre y los tejidos en el contexto de la salud y la enfermedad.

Introduction

Conocimiento científico de las características estructurales de la sinapsis inmunes T-cell y su vínculo con la actividad funcional de células T ha sido generado principalmente del estudio de líneas celulares y los clones derivado de PB. En qué medida estos resultados se refieren a las células T primarias obtenidas de sangre o tejidos linfoides humanos sigue siendo confuso, como las interfaces sinápticas de las células que residen en los tejidos linfoides y otros no han sido analizadas hasta ahora. Lo importante, los datos emergentes sugieren que reside en el tejido y derivan de órgano linfoide de las células T pueden tener diferencias en su fenotipo y su actividad funcional en comparación con aquellos en PB6,7. Esto consolidó aún más la necesidad de comprender mejor las características de la interfaz sináptica del T-cell en las células de T humanas primarias.

Para ello, hemos desarrollado un enfoque de escala mini novela explotando bicapas lipídicas soportadas en diapositivas de flujo multicanal que nos permite llevar a cabo la proyección de imagen de interfaces T-célula/bicapa con menos de 105 T las células primarias aisladas de humano PB y LN. Esta novedosa técnica permite el estudio de las propiedades biofísicas de primarias interfaces sinápticas del T-cell humanas para mejor modelo y entender en vivo las interacciones célula-célula.

Protocol

Este estudio se llevó a cabo con arreglo a la declaración de Helsinki. Se obtuvo consentimiento informado de todos los participantes, y muestras de sangre y del nodo de linfa fueron adquiridas con la aprobación de la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pennsylvania (IRB #809316, IRB # 815056). Todos los seres humanos eran adultos. Muestras de sangre de cordón fueron amablemente proporcionadas por parto de la Departamento de Obstetricia y Ginecología en la Universidad de Thomas Jefferson. Todas las …

Representative Results

En primer lugar, hemos comparado la estructura de la interfaz sináptica formada por CD8 activados derivados de sangre de cordón+ T las células expuestas a bicapas lipídicas soportadas construcción o flujo a gran escala tradicional en sistemas de la célula (véase la Tabla de materiales para más detalles)1 ,2,3,4 o en diapositi…

Discussion

La nueva técnica descrita aquí utiliza reactivos similares requeridos para construir bicapas planares de la célula de flujo convencional5 y puede ser aplicada con éxito para realizar la proyección de imagen de células T humano primario – bicapa interfaces3,4 ,15. La técnica ofrece una reducción significativa en el uso de moléculas fluorescentes y requiere 10 – 20 x menos las células de T en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la subvención del NIH R01AI118694 a Michael R. Betts, que incluye el premio 566950 a Yuri Sykulev. Agradecemos la Sidney Kimmel Cancer centro Bioimagen compartido recursos por su excelente apoyo.

Materials

CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

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Cite This Article
Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

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