Summary

Évaluation de l’Interface synaptique des cellules primaires humaines T du sang périphérique et le tissu lymphoïde

Published: July 30, 2018
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Summary

Le protocole décrit une technique pour étudier la capacité des cellules T humaines primaires polyclonaux pour former des interfaces synaptiques utilisant des bicouches lipidiques planes. Nous utilisons cette technique pour montrer la capacité de formation de synapse différentielle des cellules T primaires humaines dérivées de ganglions lymphatiques et le sang périphérique.

Abstract

La compréhension actuelle de la dynamique et les caractéristiques structurales des interfaces synaptiques de lymphocytes a été en grande partie déterminés par l’utilisation de verre-prise en charge des bicouches planaires et in vitro-T-cellule dérivée des clones ou lignes1,2 ,3,4. Comment ces conclusions s’appliquent aux primaire les cellules T humaines isolées du sang ou lymphoïdes tissus ne connaît pas, en partie en raison d’importantes difficultés à obtenir un nombre suffisant de cellules pour analyse5. Ici nous abordons cela grâce à l’élaboration d’une technique exploitant les diapositives des flux multicanaux pour construire des bicouches lipidiques planes contenant des molécules d’adhésion et d’activation. La faible hauteur des lames débit favorise la sédimentation cellulaire rapide afin de synchroniser l’attachement cellulaire : bicouche, permettant ainsi aux chercheurs d’étudier la dynamique de la formation de l’interface synaptique et la cinétique de la libération de granules. Nous appliquons cette approche pour analyser l’interface synaptique d’aussi peu que 104 105 primaire cryoconservés T cellules isolées de ganglions lymphatiques (LN) et du sang périphérique (PB). Les résultats révèlent que la technique de bicouches lipidiques planes roman permet l’étude des propriétés biophysiques des cellules T humaines primaires dérivés de sang et les tissus dans le contexte de la santé et la maladie.

Introduction

Connaissances scientifiques sur les caractéristiques structurales des synapses immunitaires lymphocytes et leur lien avec l’activité fonctionnelle des cellules T ont été recueillies principalement de l’étude des lignées cellulaires et clones provenant de PB. À quel degré ces constatations se rapportent à des cellules primaires de T a obtenu de sang ou des tissus lymphoïdes humains ne sait pas, comme les interfaces synaptiques des cellules T qui résident dans les tissus lymphoïdes et autres n’ont pas été analysés jusqu’à présent. Ce qui est important, nouvelles données suggèrent que les tissus-résident et organes lymphoïdes-dérivés des cellules T peuvent avoir des différences significatives dans leur phénotype et leur activité fonctionnelle par rapport à celles du PB6,7. Cela se solidifie davantage la nécessité de mieux comprendre les fonctionnalités de l’interface synaptique de lymphocytes dans les cellules T humaines primaires.

À cette fin, nous avons développé une approche nouvelle échelle mini exploitant des bicouches lipidiques incorporés dans les glissières des flux multicanal nous permettant d’effectuer l’imagerie des interfaces de T-cellule/bicouche avec moins de 105 primaire T cellules isolées de PB humaine et LN. Cette nouvelle technique permet d’étudier les propriétés biophysiques de humain lymphocytes synaptiques interfaces primaires pour mieux modéliser et comprendre en vivo les interactions cellule-cellule.

Protocol

Cette étude a été réalisée conformément à la déclaration d’Helsinki. Consentement éclairé a été obtenu de tous les participants, et les échantillons de sang et les ganglions lymphatiques ont été acquises avec l’approbation de l’Institutional Review Board à l’Université de Pennsylvanie (CISR #809316, la CISR # 815056). Tous les sujets humains étaient des adultes. Les échantillons de sang de cordon ont été gracieusement fournis par le travail et l’accouchement de la département d’obstétri…

Representative Results

Tout d’abord, nous avons comparé la structure de l’interface synaptique formé par CD8 activés de dérivés du sang-cordon+ T des cellules exposées à des bicouches lipidiques construit soit en écoulement à grande échelle traditionnel systèmes de cellules (voir la Table des matières pour plus de détails)1 ,2,3,4 ou dans …

Discussion

Cette nouvelle technique décrite ici utilise des réactifs similaires nécessaires pour construire des bicouches planaires dans le débit conventionnel cellule5 et peut être appliquée avec succès pour effectuer l’imagerie du primaire des lymphocytes T humains – bicouche interfaces3,4 ,,15. La technique offre une réduction significative de l’utilisation de molécules fluorescentes et nécessite…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par l’octroi de NIH de R01AI118694 à Michael R. Betts, qui inclut les prix 566950 à Yuri Sykulev. Nous remercions la Sidney Kimmel Cancer Center Bioimaging partagée ressource pour leur excellent soutien.

Materials

CD4 T cell isolation kit, human Miltenyl Biotec 130-096-533
CD8 T cells Isolation Kit, human Miltenyl Biotec 130-096-495
DOPC Avanti Polar Lipids 850375C
DOGS NTA Avanti Polar Lipids 790528C
Biotinyl Cap PE Avanti Polar Lipids 870273C
Human Serum Albumin Octapharma USA NDC 68982-643-01
sticky-Slide VI 0.4 ibidi 80608
Coverslips for sticky-Slides ibidi 10812
Bioptech FCS2 Chamber Bioptech 060319-2-03
anti-CD3 antibody Thermo Fisher Scientific 16-0037-81 OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC
anti- CD28 antibody Genetex GTX14664 9.3 clone
Casein Sigma C5890
Biotin-PEO4-NHS Thermo Fisher Scientific 21329
DMSO Sigma D2650-5
Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10235
Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification Thermo Fisher Scientific A10238
Amersham Cy5 NHS Ester GE Life Science PA15101
pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors Thermo Fisher Scientific V412020
pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection ATCC 37409
Serum free Drosophial media Insect-XPRESS Lonza 12-730Q
Hybridoma YN1/1.7.4 ATCC CRL1878 The hybridoma secrets antibody against ICAM-1.
Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B Sigma-Aldrich C9142 Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody.
MasterFlex tangential flow concentrator Cole-Parmer 77601-60 7592-40 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Centramate Lab Tangential Flow Systems Pall Laboratory FS002K10 OS010T12 FS005K10 Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30210
Dialysis tubing Spectra/Por 131384
Papain from papaya latex Sigma P3125
mouse anti-human antibody against CD107a BD Bioscences 555798 Clone H4A3
Ansell Natural Blue Gloves Fisher Scientific 19-014-539
Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps Thermo Fisher Scientific 6320-0010
Streptavidin ProZyme SA10
Confocal microscope Nikon Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table
TIRF microscope Andor Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS)
MetaMorph Premier Image Analysis Software Molecular devices

References

  1. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Somersalo, K., et al. Cytotoxic T lymphocytes form an antigen-independent ring junction. Journal of Clinical Investigation. 113, 49-57 (2004).
  3. Beal, A. M., et al. Protein kinase C theta regulates stability of the peripheral adhesion ring junction and contributes to the sensitivity of target cell lysis by CTL. The Journal of Immunology. 181, 4815-4824 (2008).
  4. Beal, A. M., et al. Kinetics of early T cell receptor signaling regulate the pathway of lytic granule delivery to the secretory domain. Immunity. 31, 632-642 (2009).
  5. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , (2007).
  6. Reuter, M. A., et al. HIV-Specific CD8(+) T Cells Exhibit Reduced and Differentially Regulated Cytolytic Activity in Lymphoid Tissue. Cell Reports. 21, 3458-3470 (2017).
  7. Buggert, M., et al. Limited immune surveillance in lymphoid tissue by cytolytic CD4+ T cells during health and HIV disease. PLoS Pathogens. 14, e1006973 (2018).
  8. Carrasco, Y. R., Fleire, S. J., Cameron, T., Dustin, M. L., Batista, F. D. LFA-1/ICAM-1 interaction lowers the threshold of B cell activation by facilitating B cell adhesion and synapse formation. Immunity. 20, 589-599 (2004).
  9. Anikeeva, N., et al. Distinct role of lymphocyte function-associated antigen-1 in mediating effective cytolytic activity by cytotoxic T lymphocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 6437-6442 (2005).
  10. Steblyanko, M., Anikeeva, N., Campbell, K. S., Keen, J. H., Sykulev, Y. Integrins Influence the Size and Dynamics of Signaling Microclusters in a Pyk2-dependent Manner. The Journal of Biological Chemistry. 290, 11833-11842 (2015).
  11. Anikeeva, N., Lebedeva, T., Sumaroka, M., Kalams, S. A., Sykulev, Y. Soluble HIV-specific T-cell receptor: expression, purification and analysis of the specificity. Journal of Immunological Methods. 277, 75-86 (2003).
  12. Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  13. Riddell, S. R., Greenberg, P. D. The use of anti-CD3 and anti-CD28 monoclonal antibodies to clone and expand human antigen-specific T cells. Journal of Immunological Methods. 128, 189-201 (1990).
  14. Lin, S. J., Yu, J. C., Cheng, P. J., Hsiao, S. S., Kuo, M. L. Effect of interleukin-15 on anti-CD3/anti-CD28 induced apoptosis of umbilical cord blood CD4+ T cells. European Journal of Haematology. 71, 425-432 (2003).
  15. Anikeeva, N., Sykulev, Y. Mechanisms controlling granule-mediated cytolytic activity of cytotoxic T lymphocytes. Immunologic Research. 51, 183-194 (2011).
  16. Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).

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Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).

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