말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가
1Department of Microbiology and Immunology,Thomas Jefferson University, 2Department of Microbiology and Institute for Immunology,Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet,Karolinska University Hospital Huddinge, 4Departments of Microbiology and Immunology and Medical Oncology, Sidney Kimmel Cancer Center,Thomas Jefferson University
Summary
프로토콜 평면 지질 bilayers를 사용 하 여 시 냅 스 인터페이스를 형성 하는 기본 polyclonal 인간 T 세포의 기능을 연구 하는 기법을 설명 합니다. 우리 림프절과 주변 혈액에서 파생 하는 인간의 기본 T 세포의 차별 시 냅 스 형성 기능을이 기법을 사용 합니다.
Abstract
역학의 현재 이해 및 T-세포 시 냅 스 인터페이스의 구조 기능 지원 되는 유리 평면 bilayers 및 생체 외에서의 사용을 통해 주로 결정 되었습니다-파생 된 T-세포 복제 또는1,2 라인 ,,34. 이러한 연구 결과 혈액에서 격리 또는 림프 기본 인간 T 세포에 적용 하는 방법 조직은 모른다, 분석5셀의 충분 한 수를 취득에 상당한 어려움 때문에 부분적으로. 여기 우리가 구축 활성화 및 접착 분자를 포함 하는 평면 지질 bilayers 멀티 채널 흐름 슬라이드를 이용 하는 기술 개발을 통해이 해결 합니다. 흐름 슬라이드의 낮은 높이 시 냅 스 인터페이스 형성의 동적과 립 방출의 속도 론을 공부 하 고 연구 함으로써 셀: bilayer 첨부 파일을 동기화 하기 위해 빠른 셀 침전을 촉진 합니다. 우리는 10 몇의 시 냅 스 인터페이스를 분석에이 접근을 적용 105 주 cryopreserved T 세포 림프 노드 (LN) 및 말 초 혈액 (PB)에서 절연 된4 . 결과 공개 소설 평면 지질 bilayer 기술 기본 인간 T 세포에서 혈액과 조직 건강과 질병의 맥락에서 파생 된의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.
Introduction
T 세포의 기능 활동에 그들의 링크와 T 세포 면역 시 냅 스의 구조적 기능의 과학적 지식을 셀 라인의 연구에서 주로 생성 되 고 클론 PB에서 파생. 어느 정도 기본 T 세포에 관련 된 이러한 연구 결과에서 얻은에 혈액 또는 인간 림프 조직 남아 있다 불분명, 림프 및 다른 조직에서 T 세포의 시 냅 스 인터페이스는 지금까지 분석 되지. 중요 한 것은, 새로운 데이터 조직 상주와 림프 기관 파생 된 T 세포의 표현 형 및 PB6,7에 비해 기능 활동에 큰 차이가 있을 수 있습니다 것이 좋습니다. 이 추가 기본 인간 T 세포에서 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 기능을 더 잘 이해할 필요가 고형화 했다.
이 위해 악용 하는 멀티 채널 흐름 슬라이드를 T-셀/bilayer 인터페이스의 이미징 105 주 T 세포와 인간의 PB를 ln. 격리 수행에 내장 된 지질 bilayers 소설 미니 규모 접근 개발 했습니다. 이 새로운 기술은 더 나은 모델 하 고 vivo에서 세포 세포 상호 작용을 이해 하기 위해 기본 인간 T 세포 시 냅 스 인터페이스의 생물 속성의 연구를 수 있습니다.
Protocol
헬싱키의 선언에 따라 연구 되었다. 모든 참가자에 게 서 얻은 서 면된 동의 하 고 혈액과 림프 노드 샘플 펜실베니아 대학 (IRB #809316, IRB # 815056) 기관 검토 위원회의 승인으로 인수 했다. 모든 인간의 과목 성인 이었다입니다. 코드 혈액 샘플을 친절 하 게 노동과 학과의 산부인과 토마스 제퍼슨 대학에서의 납품에 의해 제공 되었다. 모든 샘플 드 확인 했다입니다. 1. 절연 CD4의 ?…
Representative Results
첫째, 우리는 활성화 코드 혈액 파생 CD8에 의해 형성 된 시 냅 스 인터페이스의 구조를 비교+ T 세포 지질 bilayers에 노출 내장 중에서 전통적인 대규모 흐름 전지 시스템 (대 한 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조)1 ,2,,34 또는 멀티 채널 흐름 슬라이드. bi…
Discussion
여기에 설명 된 소설 기법 기존의 흐름 셀5 평면 bilayers 구축 하는 데 필요한 유사한 시 약을 활용 하 고 수행 기본 인간 T 세포-bilayer 인터페이스3,4의 이미징에 성공적으로 적용 될 수 있습니다. ,15. 기술은 형광 분자 사용법에 있는 뜻깊은 감소를 제공 하며 10-20는 흐름 셀 시스템5, 혈액 및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업을 지원 했다 마이클 R. Betts에 R01AI118694 NIH 교부 금에 의해 하위 수상 566950 유리 Sykulev 포함. 우리는 Sidney Kimmel 암 센터 Bioimaging 공유 리소스 그들의 탁월한 지원 위한 감사합니다.
Materials
| CD4 T cell isolation kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-533 | |
| CD8 T cells Isolation Kit, human | Miltenyl Biotec | 130-096-495 | |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
| DOGS NTA | Avanti Polar Lipids | 790528C | |
| Biotinyl Cap PE | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| Human Serum Albumin | Octapharma USA | NDC 68982-643-01 | |
| sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Coverslips for sticky-Slides | ibidi | 10812 | |
| Bioptech FCS2 Chamber | Bioptech | 060319-2-03 | |
| anti-CD3 antibody | Thermo Fisher Scientific | 16-0037-81 | OKT3 clone, hybridoma cells are available from ATCC |
| anti- CD28 antibody | Genetex | GTX14664 | 9.3 clone |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Biotin-PEO4-NHS | Thermo Fisher Scientific | 21329 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5 | |
| Alexa Fluor 488 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10235 | |
| Alexa Fluor 568 protein labeling kit with column for labeled protein purification | Thermo Fisher Scientific | A10238 | |
| Amersham Cy5 NHS Ester | GE Life Science | PA15101 | |
| pMT/V5-His A, B, C Drosophila Expression Vectors | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| pcopneo, G418 Drosophila expression vector for positive selection | ATCC | 37409 | |
| Serum free Drosophial media Insect-XPRESS | Lonza | 12-730Q | |
| Hybridoma YN1/1.7.4 | ATCC | CRL1878 | The hybridoma secrets antibody against ICAM-1. |
| Cyanogen bromide-activated-Sepharose 4B | Sigma-Aldrich | C9142 | Utilized for preparation of Sepharose with covelently bound anti-ICAM antibody. |
| MasterFlex tangential flow concentrator | Cole-Parmer | 77601-60 7592-40 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Centramate Lab Tangential Flow Systems | Pall Laboratory | FS002K10 OS010T12 FS005K10 | Used for ICAM-1 containing supernatant concentration and dialysis of ICAM-1 containing supernant |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30210 | |
| Dialysis tubing | Spectra/Por | 131384 | |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | |
| mouse anti-human antibody against CD107a | BD Bioscences | 555798 | Clone H4A3 |
| Ansell Natural Blue Gloves | Fisher Scientific | 19-014-539 | |
| Nalgene Polypropylene Scissor-Type Forceps | Thermo Fisher Scientific | 6320-0010 | |
| Streptavidin | ProZyme | SA10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope equipped with PFS for long-term image stability control, 60x oil objectives, 4 lasers with excitation lines at 405, 458, 488, 514, 561, and 640 nm, 2 GaAsP detectors and 2 high sensitivity PMTs, DIC transmitted light, Programmable X,Y,Z stage for multiple positions and stitching of large areas, time lapse functions, Tokai-Hit temperature and CO2-controlled chamber for live imaging, and anti-vibration isolation table | |
| TIRF microscope | Andor | Andor Revolution XD system equipped with Nikon TIRF-E illuminator, Lasers with 405,488,561 and 640 lines, DIC transmitted light, Yokogawa CSU-X1 spinning disk head for confocal imaging, 100/1.49 NA objective, Andor iXon X3 EM-CCD camera, objective heater, and a piezoelectric motorized stage with Perfect Focus System (PFS) | |
| MetaMorph Premier Image Analysis Software | Molecular devices |
References
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Cite This Article
Steblyanko, M., Anikeeva, N., Buggert, M., Betts, M. R., Sykulev, Y. Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue. J. Vis. Exp. (137), e58143, doi:10.3791/58143 (2018).