Behoud van de biologische culturen en meten van de genexpressie in Aphis Oleanderpijlstaart: een Non-modelsysteem voor Plant-insect interacties

Bladluizen zijn kleine, hemimetabolous insecten die op uiteenlopende plantenfamilies wereldwijd koloniseren. Ze zijn meest onderscheidende voor verschillende functies, met name complexe productlevenscyclus met cyclische parthenogenese en discrete polyphenisms, en hun obligate voeding symbiose met bacteriën of de gist endosymbionten die voedingsstoffen ontbreekt te verstrekken hun dieet van plant sap¹. Terwijl de meeste bladluizen gastheer plant specialisten zijn, sommige soorten generalist zijn belangrijk gewas plagen, toebrengen van aanzienlijke economische schade op gewassen hetzij rechtstreeks of via de ziektekiemen en virussen zij²vector. De publicatie van het eerste bladluis genoom in 2010, de erwt bladluis Acyrthosiphon pisum³, een belangrijke mijlpaal in de studie van biologie van de bladluis gemarkeerd omdat daarin de genomic middelen voorzien in aanpak vragen over het insect aanpassingen aan de herbivore leefstijlen, waaronder bronnen die tot een beter beheer strategieën^{4 leiden kunnen}. Sinds die tijd, hebben extra genomic middelen opgebouwd met de publicatie van een geannoteerde genoom voor de soja bladluis Aphis glycines⁵en -openbaar hele genoom bronnen voor een andere drie-bladluis soort (groene cerasi (black cherry bladluis), Groene perzikluis (perzik-aardappel bladluis), Rhopalosiphum padi (gewone vogelkers-haver bladluis)⁶. Waardevolle DOVO transcriptomic bronnen zijn beschikbaar alsook voor een aantal andere soorten bladluis (e.g.,Aphis gossypii (katoen bladluis)⁷, Sitobion avenae (graan bladluis)⁸, Cinara pinitabulaeformis (pine bladluis)⁹, Aphis Oleanderpijlstaart (Kroontjeskruid-oleander bladluis)¹⁰).

Bladluizen heb ook blijvende bijdragen aan ons begrip van de plant-insect interacties en de ecologie van het leven op planten¹¹. Een gebied waar de bladluizen bijzonder belangrijke bijdrage hebben geleverd is in ons begrip van de chemische ecologie van de gastheer plant interacties. Plantenetende insecten uiten diverse aanpassingen voordeel voor overwinnen plant verdediging, en sommige zelfs plant verdediging voor hun eigen coöpteren^12,13,14. Bijvoorbeeld, is de Kroontjeskruid-oleander bladluis, Aphis Oleanderpijlstaart, een fel geel, invasieve bladluis gevonden in gematigde en tropische gebieden wereldwijd die op planten uit de familie Kroontjeskruid (maagdenpalmfamilie koloniseert). Planten uit de familie maagdenpalmfamilie geëvolueerd verschillende chemische verdediging, met inbegrip van melkachtig latex en cardiale glycosiden bekend als cardenolides, die de vervoerder catie Na, K-ATPase binden en doeltreffend afschrikmiddel dienen tot generalist herbivoren^{15, 16}. Kroontjeskruid specialisten express verschillende modi bestandheid tegen cardenolides en sommige selectief of passief accumuleren of wijzigen van cardenolides in hun weefsels als een middel om af te schrikken van predatie of voor andere voordelen¹⁷. A. Oleanderpijlstaart wordt gedacht aan het sekwestreren cardenolides op deze manier, hoewel de mechanismen en functionele voordelen onduidelijk^{10,18 blijven}.

Gezien de genomic middelen bij de hand, geeft A. Oleanderpijlstaart een uitstekend experimenteel model voor de studie van de moleculaire en genetische mechanismen die betrokken zijn bij de chemo-ecologische interacties tussen toxische gastheerplanten en hun specialist herbivoren. Het is vermeldenswaard dat, terwijl enkele van de vroegste studies van A. Oleanderpijlstaart gericht op reductie van cardenolides¹⁹, sinds die tijd, studies van A. Oleanderpijlstaart inzicht in een breed scala van evolutionaire en ecologische aangelegenheden verstrekt hebben, met inbegrip van de genetische structuur van invasieve insecten²⁰ en de wisselwerking tussen de verordening van onderop en de top-down op de herbivoor dichtheid²¹. A. Oleanderpijlstaart is dus een goede kandidaat als een experimenteel model voor een bijzonder breed scala van studies van de plant-insect interacties. Kritiek voor het succes van een studie met A. Oleanderpijlstaart is de zorgvuldige cultuur van bladluis populaties, waarin de cultuur van planten waarvan de bladluizen afhankelijk zijn, evenals een efficiënte generatie van hoge kwaliteit - dienst gegevens. Ons doel is om te leiden de lezer door beide. Hieronder zijn methoden voor het genereren en het onderhoud van de installaties en bladluis culturen in de broeikasgassen en laboratorium, DNA en RNA extracties, microsatelliet analyse, DOVO transcriptome vergadering en aantekening, transcriptome differentiële expressie analyse en qPCR verificatie van differentially uitgedrukte genen. Terwijl deze methoden zijn geschreven voor A. Oleanderpijlstaart, kunnen het algemene kweken, extractie en analyse methoden vergroot worden tot een verscheidenheid van soorten van de bladluis.

1. plant culturen

1. Zaden aanschaffen bij een commerciële leverancier of verzamelen van volwassen planten in het veld.
   Opmerking: Dit protocol is geschikt voor de meeste commercieel beschikbare Kroontjeskruid soorten (bijvoorbeeld Asclepias incarnata, A. curassavica, A. syriaca, Gomphocarpus physocarpus). Sommige zaden wellicht worden koude-gelaagde en instructies van de leverancier van het zaad moeten worden gecontroleerd.
2. Plant de zaden in een fijne kiemende bodem (60-70% fijne veenmos, perliet, vermiculiet, kalksteen).
   1. Vul een lade standaard zaailing met kiemkracht mix bodem; ervoor te zorgen dat de bodem de top van de putten bereikt. Controleer in elk putje, een kuiltje maken een gat in de bodem over een 3 cm diep.
   2. Plaats een zaad in elk gat en water zeer goed met een gieter zodat de bodem heeft betrekking op de zaden en is verzadigd.
   3. Groeien van zaden in een kas (zie voorwaarden hieronder, 1.5). Regelmatig water dagelijks om elk-ander-dag; genoeg om het bodemvocht naar een matig niveau.
3. Wanneer de zaailingen hebben hun eerste set van volledige bladeren gegroeid, opnieuw pot zaailingen in een algemene potgrond mengen (50 – 60% veenmos, schors en kalksteen) (Figuur 1).
   1. Gebruik 4-inch ronde potten die bij een strakke verbinding met het kopje kooien passen. Vul met algemene potgrond tot ongeveer 5 cm onder de rand.
   2. Maak een gat in de bodem diep genoeg om de onderkant van de pot.
   3. Met de hand, de volwassen zaailing uit de put schep voorzichtig en plaats het diep in het gat in de pot van 4 inch. Dekken de zaailing met de bodem. Water erg goed.
   4. Planten groeien in de serre en het water regelmatig, dagelijks naar elke andere dag; genoeg om te handhaven matig bodemvocht.
4. Broeikasgassen voorwaarden.
   1. Stel de broeikasgassen thermostaten om overdag temperaturen tussen 18-28 ° C en 's nachts temperaturen tussen 16-22 ° C met behulp van de instructies van de fabrikant.
   2. Tijdens de wintermaanden wanneer de dagen korter zijn, een aanvulling op het daglicht met 600 W hogedruk natrium lampen (12 h, 8 am-8 pm).
5. Controle van ongewenste ongedierte (bijvoorbeeld, trips, bladluizen) met een naalden biologische zeepoplossing, echter, het gebruik van deze producten met de nodige voorzichtigheid.
   1. De zeepoplossing volgens de aanbevelingen van de fabrikant te maken en toe te passen met behulp van een spuitfles.
   2. Laat de zeep op de planten voor 4-24 h. Spoel zachtjes de planten met water te verwijderen van de zeep 4-24 h na toepassing en spoel ze met water een tweede tijd vóór gebruik met laboratorium bladluis culturen.
6. Cultuur de gemiddelde bladluis bevolking op planten die ten minste 3-4 sets van volledige bladeren gegroeid en ten minste 10 cm hoog (Figuur 1B).

2. bladluis culturen

1. De bevolking van de bladluis laboratorium starten vanuit een bestaande lab isoclonal bevolking of starten vanaf het veld-verzameld bladluizen volgens de aanwijzingen hieronder.
   1. Wanneer een laboratorium bevolking vanaf een bestaande lab isoclonal bevolking, overbrengen bladluizen zoals beschreven in 2.3.1–2.3.3.
2. Wanneer starten de nieuwe isoclonal, veld-verzameld bladluis populaties en plaats van een enkele, weergeven, volwassen bladluis op een geschikte waardplant, zoals vermeld in stap 1.6.
   Opmerking: Populaties kunnen gestart worden vanaf gevleugelde (mond) of ongevleugelde (apterous) volwassenen.
   1. Handmatig controleren planten uit de kas voor ongewenste ongedierte voorafgaand aan het gebruik met laboratorium bladluizen. Bevriezen van alle planten met ongewenste bladluizen. Indien gewenst, gebruik een ethanol vacuüm kolf trips of ander ongedierte te verwijderen.
      Opmerking: Zorg ervoor dat planten die zijn behandeld met zeep vóór gebruik zoals beschreven in stap 1.5.2 afspoelen.
   2. Veilig overbrengen een enkele volwassen bladluis met behulp van een penseel of een mond pipet gemaakt met ID 3/16" x 1/4" OD kunststof buis, een 1.000 µL pipette uiteinde en een 2,00 µL pipette uiteinde(Figuur 2).
   3. Veilig planten met bladluizen te bedekken met een cup kooi gemaakt met een plastic beker met de bovenkant afgesneden, bedekt met een fijn gaas en beveiligd met tape (Figuur 2B).
   4. Bladluis-aangetaste planten te plaatsen in een lade en bewaar op een gecontroleerde milieu kamer (16 L: 8D, 22 ° C, luchtvochtigheid van 70%).
3. Om te behouden de voorraad bevolking, door bladluizen te overbrengen in frisse, nieuwe planten wekelijks (2.2.1–2.2.3).
   1. Veilig overdragen 1 – 3 2^nd of 3^rd instar nimfen en 1 volwassene leeftijd bladluizen met behulp van een precisiepipet mond (cijfers 2A, 3).
      Opmerking: Voorraden worden beste onderhouden door de overdracht van de ongevleugelde individuen.
   2. Veilig bladluis-aangetaste planten met een cup kooi gemaakt met een plastic beker met de bovenkant afgesneden, bedekken, bedekt met een fijn gaas en beveiligd met tape.
   3. Plaats van planten in een lade en bladluizen droog in een milieu kamer (16 L: 8D, 22 ° C, luchtvochtigheid van 70%).
   4. Als alternatief, als gewenst en als de waardplant van fatsoenlijke kwaliteit is, een ethanol vacuüm kolf gebruikt om de bevolking verlaten reproduceren van slechts één volwassen en twee tot drie 2e of 3e instar nimfen.
4. Om te maken dezelfde bevolking voor het gebruik in experimenten, plaatst u maximaal 5 volwassenen (bij voorkeur ongevleugelde) uit voorraad populatie op een nieuwe waardplant.
   1. Verwijder de volwassenen 24 h later.
   2. Ongeveer 5-7 dagen later, plaatsen zodra de F₁ nakomelingen hebben gerijpt naar volwassenheid, maximaal 5 ongevleugelde F₁ volwassenen op een nieuwe waardplant. Verwijder de volwassenen 24 h later.
   3. Zodra de F₂ bevolking heeft gerijpt naar volwassenheid, is deze populatie klaar om te worden gebruikt in experimenten.
      Opmerking: Dit proces zorgt ervoor dat de experimentele bevolking ongeveer is dezelfde leeftijd en van ongeveer dezelfde leeftijd moeders zijn geboren.
5. Bevestig de genotypische verschillen tussen veld-gevangen isoclonal lijnen met behulp van microsatelliet genotypering (hieronder beschreven, afdelingen 3 & 4).

3. DNA-extractie

1. Voorbereiding
   1. Steriele technieken gebruiken om te bereiden 1 L lysis buffer (0,1 M NaCl, 0,2 M sacharose, 0,1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA 0,05% SDS).
   2. Warm het blok van de verwarming of water bad tot 65 ° C.
2. Weefsel homogenisering en lysis
   1. Plaats de bladluis in de buurt van de onderkant van een steriele, 1,5 mL microcentrifuge buis.
   2. Plaats de steriele stamper in de buis met de bladluis en de onderkant van de buis in vloeibare stikstof onder te dompelen.
      Opmerking: Optimale weefsel desintegratie wordt bereikt wanneer de bladluis is gepositioneerd tussen de stamper en de kant van de buis.
   3. Het malen van de bladluis met de stamper aanvankelijk lyse cellen.
   4. Gebruik voor een enkele volwassen bladluis, 200 µL (gesplitst in 2 x 100 µL aliquots) van de lysis-buffermengsel. Voeg het eerste monster om te slijpen en resuspendeer de geplette bladluis totdat het monster zichtbaar is uiteengevallen, dan gebruik het tweede monster te spoelen uit de stamper.
   5. Incubeer de geplette bladluizen in lysis-buffermengsel bij 65 ° C in het water bad of warmte blok voor 30 min.
3. DNA neerslag
   1. Terwijl de buis warm is, voeg 14 µL van 8 M KOAc. Omkeren van de buis te mengen. Bewaar het monster op het ijs gedurende 30 minuten.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot 24 h.
   2. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Het supernatant overbrengen in nieuwe 1,5 mL-buis met een pipet. Wees voorzichtig niet te verwijderen om het even welk van het Ingehuld puin.
   3. Ter verbetering van DNA pellet visualisatie, voegt u 2 µL glycogeen (20 µg/mL) toe aan het supernatant. Als de grootte van de steekproef groot genoeg is, weglaten deze stap.
   4. 200 µL van koude 100% moleculaire-grade ethanol toevoegen aan het supernatant. Omkeren buizen om te mengen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot 24 h.
   5. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen van ethanol door pipetteren.
4. DNA wassen en elutie
   1. Voeg 200 µL van koude 70% moleculaire-grade ethanol. Vervolgens flick de buis te resuspendeer de pellet te wassen.
   2. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 5 min. Terwijl het visualiseren van de pellet, verwijder voorzichtig de ethanol door pipetteren en het toevoegen van 200 µL van koude 100% moleculaire-grade ethanol.
   3. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 5 min. Tijdens het visualiseren van de pellet, verwijder voorzichtig ethanol door pipetteren.
      Let op: Herhaal de 100-70-100 ethanol wassen indien nodig.
   4. Lucht drogen de pellets voor 5 – 10 min met de aanleg van de buis horizontaal geopend op een papieren zakdoekje.
   5. Resuspendeer de pellet DNA in 80 µL voor lage TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA).
   6. Kwantificeren van de geresuspendeerde DNA met een spectrofotometer.
   7. Bewaren bij 4 ° C.

4. microsatelliet PCR en volgorde van bladluis genotypering

1. Bestel de juiste F- en R inleidingen voor microsatelliet sequencing (tabel 1²⁰).
   Opmerking: Reverse primer sequenties moeten worden gewijzigd met 5'-6-FAM of 5'-5-HEX fluorescerende etiketten te maken voor multiplexed monsters voor microsatelliet sequencing.
2. PCR met enkele bladluis DNA-monsters (beschreven in sectie 3) en fluorescently geëtiketteerde microsatelliet inleidingen uitvoeren.
   1. Meng PCR reacties volgens protocol van de fabrikant (0,2 µM elke F/R primer, 2.5 mM MgCl₂, 50 – 200 ng DNA sjabloon).
   2. Gebruik de volgende instellingen thermocycler: eerste denaturatie bij 94 ° C gedurende 4 min, 35 cycli van 94 ° C voor 30 s, 58 ° C gedurende 35 s, 72 ° C gedurende 45 s, en een definitieve rek stap bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
3. PCR monsters combineren met verschillende TL tags te verminderen het aantal monsters sequenced en volgorde de microsatelliet monsters op een genotypering faciliteit.
4. Het analyseren van de .fsa raw voorbeeldbestanden met behulp van de software van de analyse van de microsatelliet.

5. RNA extractie

1. Verzamelen van de bladluizen monsters voor RNA extractie in 1,5 mL RNase / DNase-vrije buizen en onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof.
   Opmerking: Als de volgende stappen zijn niet onmiddellijk uitgevoerd, kunnen de monsters worden opgeslagen bij-80 ° C.
2. Weefsel homogenisering
   1. Met de steriele stamper in de buis met bladluis, bevriezen in vloeibare stikstof voor 10-15 seconden tot het monster stop sissende. Plet de bladluis goed met de stamper, zoals beschreven in stap 3.2.
      Opmerking: Optimale weefsel desintegratie wordt bereikt wanneer de bladluis is gepositioneerd tussen de stamper en de kant van de buis.
   2. Voeg in de zuurkast, 800 µL guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform extractie reagens toe aan het monster (1 – 5 volwassen bladluizen). Meng monsters met de stamper en de afzet van de stamper.
3. Fase-separatie zichtbaar
   Opmerking: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast.
   1. Incubeer de gehomogeniseerde monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 160 µL van chloroform aan monster. Schud krachtig met de hand voor 15 s.
   2. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer gedurende 15 min bij 12.000 x g bij 4 ° C.
      Opmerking: Na centrifugeren, het mengsel worden gescheiden in 3 lagen: een lagere, rode fenol-chloroformfase, een interfase en een kleurloze bovenste waterfase. Het RNA blijft uitsluitend in de waterige fase. Het volume van de waterige zullen ~ 480 µL.
4. RNA neerslag
   1. In een zuurkast, door de waterfase te overbrengen in een frisse, RNase-gratis buis. De tussenliggende fase niet storen.
   2. Neerslaan van het RNA door toevoeging van 400 µL van isopropanol en Incubeer het monster bij-20 ° C gedurende 10 minuten.
      Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken en monsters kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot 24 h.
   3. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C.
5. RNA wassen en elutie
   1. Verwijder het supernatant; Kijk voor de RNA-pellet.
   2. Wassen van de RNA-pellet met 1 mL van 75% ethanol in DEPC-behandeld water. Meng door langzaam vortexing. Centrifugeer gedurende 5 min bij 7.500 x g bij 4 ° C.
   3. Herhaal de stappen 5.5.1–5.5.2 om te helpen verwijderen van fenol contaminanten.
   4. Verwijder het supernatant en lucht drogen de pellet voor 5-10 min met buis leggen horizontaal open op een steriele bankje. Laat niet de RNA-pellet volledig drogen.
   5. Los van de RNA-pellet in 30 µL van RNase-gratis of DEPC-behandeld water. Pipetteer zachtjes op en neer om te mengen. Incubeer bij 55-60 ° C gedurende 10 à 15 min.

6. RNAseq DOVO Transcriptome vergadering, aantekening en differentiële expressie analyse

1. RNA monster concentratie en kwaliteit met behulp van een chip gebaseerde capillaire elektroforetische systeem analyseren.
   Opmerking: Een capillaire elektroforese chip gebaseerde systeem is de voorkeur methode van keuze dan analyseren met een spectrofotometer, omdat het een meer nauwkeurige en gevoelige maatregel van RNA concentratie en kwaliteit biedt.
   1. Als voorbeelden zijn van passende kwaliteit (≥ 250 ng totaal, RIN (RNA Integrity nummer) ≥ 5), RNA sequencing uitvoeren
      Opmerking: Belangrijker, omdat deze rangschikken gegevens zal worden gebruikt voor beide expressie profilering en DOVO transcriptome montage, meer lezen diepte zal resulteren in een hogere kwaliteit transcriptome. Voor een redelijk uitgebreide vergadering gebruikend de technologie van de sequencing van Illumina, 100 – 200 miljoen 100 bp, zou de gepaarde einde leest een aanbevolen uitgangspunt. Totale mRNA bibliotheek voorbereiding en RNA sequencing werden uitgevoerd door een sequencing faciliteit.
2. Controleer de kwaliteit van leest met behulp van snel QC²².
3. Combineer alle monster leest en monteren van de transcriptome DOVO met behulp Trinity^23,24 (Trimmomatic kwaliteit filteren ingeschakeld).
4. Verfijnen van de vergadering
   1. Gebruik Transdecoder²⁵ te identificeren open lezing frames (ORFs) die een minimum van 100 aminozuren in lengte.
   2. Homologie zoekopdrachten voor de vertaalde ORFs tegen Pfam²⁶ en UniProt²⁷ databases die gebruikmaken van BLASTP²⁸ en HMMER²⁹, respectievelijk.
   3. Verwijderen van bacteriële afschriften (een vertaalde reeks waarvan beste BLAST raken was om een bacteriële gen met een bit-score van meer dan 300 en een minimale aminozuur reeks identiteit van 50%).
   4. Een complete, vertaalde ORFs die ten minste 99% identiek op het niveau van de aminozuur met behulp van CD-HIT³⁰samenvouwen.
   5. De resterende, onvolledige ORFs die ten minste 95% identiek op het niveau van de nucleotide met behulp van CD-HIT³⁰samenvouwen.
   6. Het toewijzen van het resterende nucleotidesequenties met unieke, soortspecifieke-id's (bijvoorbeeld, APHNE 0001).
5. Beoordelen de volledigheid van de verfijnde vergadering, met behulp van BUSCO (http://busco.ezlab.org/) en de Arthropoda gene dataset³¹.
6. Transcriptome aantekening
   1. Eerst, annoteren verfijnde transcriptome met behulp van HMMER tegen de Pfam database^26,29.
   2. Ten tweede, annoteren met behulp van de BLASTP tegen de UniProt database^27,28transcriptome.
   3. Ten derde, annoteren met behulp van de BLASTP tegen de codering sequenties van geselecteerde insecten met gepubliceerde, geannoteerde genoom transcriptome.
   4. Laatst, annoteren met behulp van de BLASTP tegen de erwt bladluis eiwit database alleen transcriptome.
   5. Gebruik Trinotate voor het genereren van GO aantekeningen uit UniProt toetredingen.
   6. Gebruik Trinotate om te organiseren van alle resultaten van de aantekening in een SQLite database en een aantekening rapport wilt genereren.
7. Differentiële expressie analyse
   Opmerking: Het gebruik van verfijnde transcriptome als referentie, uitlijnen en kwantificeren van elke bibliotheek afzonderlijk.
   1. Gebruik Trimmomatic aan kwaliteit-filter en trim de oorspronkelijke Lees bestanden³².
      Opmerking: Als u deze stap uitvoert na een vergadering van de drie-eenheid, kan men in plaats daarvan de Trimmomatic output van die stap gebruiken.
   2. Lokale aanpassingen uitvoeren voor elk monster met behulp van Bowtie2³³.
   3. Pak de Lees graven uit elk afzonderlijk met behulp van SAMtools³⁴monster.
   4. Berekenen van de differentiële expressie tussen de monsters van belang met behulp van DESeq2 met de standaardparameters en een parametrische passen³⁵.

7. qPCR verificatie van Differentially uitgedrukte genen

Opmerking: Als gebruikers zijn geïnteresseerd in differentially uitgedrukte genen uit hun RNAseq-experimenten, het volgende protocol kan worden gebruikt om te controleren of patronen van differentiële expressie.

1. Het genereren van RNA monsters zoals beschreven hierboven (stap 5).
2. Kwantificeren van RNA extracties uit te voeren met behulp van een spectrofotometer te controleren op de kwaliteit en de concentratie te krijgen.
3. Synthetiseren cDNA monsters met behulp van een commercieel beschikbare kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
4. Het bepalen van de efficiency van de primer voor de genen van belang om ervoor te zorgen nauwkeurige twee-voudige PCR versterking.
   1. Op basis van de oorspronkelijke concentraties van RNA, uitvoeren seriële verdunningen (10¹) te verkrijgen van 3 cDNA concentraties.
   2. Met behulp van een kwantitatieve PCR master mix, meng drievoudige qPCR reacties volgens drie primer concentraties die gebruikmaakt van de fabrikant-protocol (bijvoorbeeld 100 nM, 200 nM, 300 nM) met drie serieel verdunde cDNA concentraties (bijvoorbeeld 0.1 ng/µL, 10 ng/µL, 100 ng/µL).
   3. Voor elk doel-gen, berekenen de helling (m) van de lijn die is gecreëerd met de gemiddelde C_t -waarden voor elk monster als de afhankelijke variabelen en het logboek (cDNA concentratie) als de onafhankelijke variabelen (drie punten totaal).
   4. De volgende vergelijking gebruiken voor het berekenen van de efficiëntie van de primer (E) waar m wordt de helling in 7.4.3 berekend:
      E = 10^(-1/m)
      Opmerking: Primer efficiëntie tussen 90-110% zijn geschikt voor analyses. Dit proces zorgt voor versterking van de gelijke van alle genen in de berekeningen opgenomen.
5. De ΔΔC_t -methode gebruiken met een huishouden gen te kwantificeren van de differentiële expressie van genen van belang³⁶.

Planten van culturen: Zaden duurt ongeveer twee tot vier weken, afhankelijk van het seizoen, om te groeien groot genoeg om opnieuw gepot (Figuur 1A). Opnieuw gepot zaailingen duurt nog twee tot vier weken te groeien naar een optimale grootte voor bladluis culturen (Figuur 1B).

Bladluis culturen: Volwassen A. Oleanderpijlstaart onderscheiden zich door sommige donkere cauda en ongevleugelde kan worden (apterous, Figuur 3A, B) of de winged (mond, Figuur 3C, D). Ontwikkelende vleugel pads worden zichtbaar wanneer nimfen de derde instar (Figuur 3,E, F bereikt). Stamculturen worden beste onderhouden door overdracht van één tot drie halverwege instar en één volwassene leeftijd ongevleugelde bladluizen; Dit zorgt voor een gezonde, gemengd beroepsbevolking. Populaties worden gebruikt voor experimenten moeten worden gekweekt met behulp van ongevleugelde bladluizen zoals beschreven hierboven (2.4). 1 A. Oleanderpijlstaart volwassene kan het produceren van 3-10 nakomelingen per dag, afhankelijk van de waardplant en de bladluis¹⁰-jarige leeftijd.

DNA en RNA extracties: Enkele, volwassen A. Oleanderpijlstaart zal opleveren ongeveer 100 – 200 ng/µL DNA (80 µL elutie; Figuur 4 A) en 150-300 ng/µL RNA (30 µL elutie; Figuur 4 B). vertegenwoordiger microsatelliet pieken zijn afgebeeld in Figuur 5. Representatieve relatieve expressie van een kandidaat-gen onder drie omstandigheden (control, 1 behandeling, behandeling 2) worden berekend in tabel 2 en in Figuur 6afgebeelde.

Figuur 1 : Representatief planten voor bladluis culturen. (A) zaailingen kunnen opnieuw gepot nadat ze hun eerste volledige set van echte bladeren hebben ontwikkeld. (B) planten kunnen worden gebruikt voor bladluis culturen wanneer ze 3-4 sets van echte bladeren hebben ontwikkeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Voorbeelden van hulpmiddelen die gebruikt worden voor het kweken van bladluizen. (A) mond pipetten kunnen worden gemaakt met behulp van ID 3/16" x 1/4" OD kunststof buis, een 1.000 µL pipette uiteinde en een 200 µL pipette uiteinde. (B, C) Gebruik cup kooien (doorzichtige plastic bekers met de top afgesneden en beveiligd met fijn gaas) aan veilig over de bovenkant van 4 inch potten voor bladluis culturen gebruikt. Dit zorgt voor voldoende licht en ventilatie te creëren van een gunstig klimaat voor de bladluizen en plant, en houdt de bladluizen bevatte. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Representatief volwassene en nimf Aphis Oleanderpijlstaart. (A, B) Apterous (ongevleugelde) volwassen A. Oleanderpijlstaart worden aangeduid met donkere cauda op hun achterste einde. (C, D) Mond (gevleugeld) volwassenen zijn geïdentificeerd door volledig ontwikkelde vleugels en verduisterd cauda op hun achterste. (E, F) Ontwikkelende A. Oleanderpijlstaart nimfen vier instar stadia doorlopen en ontwikkelende vleugel pads duidelijk worden tijdens de derde fase van de instar. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Representatief gels. (A) DNA extracties (ladder 1 kb). Zeven A. Oleanderpijlstaart DNA extracties worden gevisualiseerd in rijstroken 3-9. Negatieve controle is in lane 10. (B) RNA extracties. Elf A. Oleanderpijlstaart RNA extracties worden gevisualiseerd in rijstroken 3-13. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : Vertegenwoordiger microsatelliet pieken. 6-FAM-gelabeld pieken zijn gevisualiseerd in blauw. LIZ-500 ladder wordt weergegeven in oranje. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : qPCR controle van een differentially uitgedrukte gen. Representatieve mRNA relatieve hoeveelheid (RQ) expressie (berekend volgens de methode van de ΔΔCt, tabel 2) weergegeven voor een kandidaat-gen van belang onder drie voorwaarden: controle, behandeling 1 behandeling 2. Grafiek toont een verminderde expressie van kandidaat-gen onder behandelingen 1 en 2 in vergelijking met het besturingselement (tabel 2). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel 1: microsatelliet primer sequenties gebruikt om genotype APHIS Oleanderpijlstaart ²⁰ .

Tabel 2: berekeningen voor qPCR ΔΔC _t controle van kandidaat-gen. Kandidaat-genexpressie wordt berekend ten opzichte van de ef1a (Figuur 6). Monsters van 1.1-1.6 vertegenwoordigen zes biologische repliceert onder de controle behandeling; monsters van 2.1-2.6 vertegenwoordigen zes biologische repliceert onder behandeling 1; 3.1-3.6 vertegenwoordigen zes biologische repliceert onder behandeling 2 monsters. C_t Std. Dev. is berekend op basis van drie technische replicatieonderzoeken.

Het heeft lang erkend dat de aposematic A. Oleanderpijlstaart verwerven in de patronen en mechanismen van resistentie aan de verdediging van de plant en met name chemische sekwester^{18,37 inzicht kunt}. Een aantal van de genomic middelen opgedoken onlangs voor A. Oleanderpijlstaart¹⁰, biedt nieuwe mogelijkheden voor ecologische en functionele genomic studies die A. Oleanderpijlstaart als een model gebruiken. We schetsen fundamentele protocollen in de bladluis en plant cultuur en moleculaire/genomische technieken, met de veronderstelling dat de toekomstige werkzaamheden op dit soort studies die gebruik maken van genomic en functionele ecologische benaderingen waarschijnlijk zal betrekken. Veel open vragen blijven over de mechanismen en de betekenis van cardenolide ontgifting en koolstofvastlegging in A. Oleanderpijlstaart. Technieken zoals RNAi voor expressie knockdown of gene bewerken benaderingen zal in dit verband waardevol blijken.

Eén van de uitdagingen bij het kweken van bladluizen is in hun wonderbaarlijke capaciteiten voor de reproductie en verspreiding. Deze eigenschappen, die rechtstreeks betrekking hebben op waarom ze ernstige gewas plagen, betekent dat bladluis culturen bijna dagelijks aandacht vereisen zijn, als goed als uiterste zorg als isogene lijnen zijn vereist voor experimenten. De technieken hierboven beschreven, met inbegrip van die voor het genereren van gegevens voor de analyse van genexpressie, terwijl gelijkaardig aan algemene protocollen voor bladluis fokken en moleculaire analyse, zorgen voor een specifieke stapsgewijze handleiding voor het genereren van voldoende biologische materiaal voor A. Oleanderpijlstaart voor een gevarieerde set van moleculaire en ecologische toepassingen.

Te dien einde als functionele of ecologische genomic studies aan de horizon voor A. Oleanderpijlstaart zijn, moet deze gepaard gaan met levende culturen te volledig profiteren van de experimentele mogelijkheden die ze bieden. Insect herbivoren leven in complexe gemeenschappen op hun waardplanten, en zowel intraspecifieke interacties^38,39 evenals interspecifieke interacties⁴⁰ vorm de uiteindelijke reactie van A. Oleanderpijlstaart op hun waardplanten . De waardplanten, A. Oleanderpijlstaart specialiseren op, vertegenwoordigen een gevarieerde set van planten die uitdrukking geven aan uiteenlopende levensgeschiedenis strategieën^15,21, onderstrepen het belang van zuiver genomic of fysiologische benaderingen met koppeling experimentele manipulaties die natuurlijk voorkomende variatie in A. Oleanderpijlstaart Gemeenschappen. De hier geschetste methoden zijn uitgangspunten voor een functionele en ecologische genomic perspectief op A. Oleanderpijlstaart en haar interactie met giftige waardplanten.