Дифференциация, техническое обслуживание и анализ клеток человека сетчатки пигментного эпителия: модель болезни в блюдо для BEST1 перегласовок
Summary
Здесь мы представляем протокол дифференцировать от человеческих плюрипотентных стволовых клеток, имея пациента производные мутации клетки сетчатки пигментного эпителия (ПЭС). Мутант клеточных линий может использоваться для функционального анализа, включая immunoblotting, иммунофлюоресценции и фиксации. Этот подход болезни в блюдо обходит трудности получения собственных клеток человека ПЭС.
Abstract
Хотя более 200 генетических мутаций в гене BEST1 человека были выявлены и связанные с дегенеративными заболеваниями сетчатки, патологические механизмы остаются недостижимой главным образом из-за отсутствия хорошего в vivo модель для изучения BEST1 и его мутации в физиологических условиях. BEST1 кодирует ионного канала, а именно BESTROPHIN1 (BEST1), которая функционирует в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС); Однако крайне ограниченный доступ к родной НПП клеток человека представляет собой серьезную задачу для научных исследований. Этот протокол описывает способы создания человеческого RPEs, принимая BEST1 болезнетворные мутации индуцированных дифференциация от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Как hPSCs самостоятельно возобновляемых источников, такой подход позволяет исследователям иметь устойчивый источник hPSC-RPEs для различных экспериментальных анализов, например immunoblotting, иммунофлюоресценции и фиксации и таким образом обеспечивает очень мощную модель болезни в блюдо для BEST1-связанный сетчатки условий. В частности эта стратегия может применяться для изучения физиологии НПП (патолого) и других генов изначально заинтересованности в ПЭС.
Introduction
Это задокументировано, что по крайней мере пять сетчатки дегенеративные заболевания вызваны генетические мутации в BEST1 гена1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, количество зарегистрированных мутаций уже более 200 и все возрастающего. Эти BEST1-сопутствующих заболеваний, также известный как bestrophinopathies, причиной потери прогрессивное видение и даже слепоты, и в настоящее время нет эффективного лечения. Белковый продукт BEST1, а именно BESTROPHIN1 (BEST1), является Ca2 +-активированные канал Cl– (CaCC) конкретно выражена в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) глаза5,6, 8,9. Важно то, что клинический фенотип BEST1-сопутствующих заболеваний является снижение визуальные ответ на свет стимулы, называется свет пик (LP) измеряется в,10электроокулограммой11; Считается, что LP опосредовано CaCC в НПП12,,1314. Для того чтобы лучше понять патологических механизмов BEST1 перегласовок и работать в направлении потенциальных терапий, важно изучить мутантов BEST1 каналы эндогенно выражена в клетках человека ПЭС.
Однако получение НПП клетки непосредственно из живых пациентов очень непрактично. Хотя родной НПП клетки могут быть собраны из биопсии человеческих трупов и плодов, трудно доступности к этим источникам значительно ограничивает научные исследования. Таким образом важно иметь альтернативные НПП источников, отличных от человеческих глаз. Этот призыв был дан ответ на недавние выдвижения в технологии стволовых клеток, как функциональные НПП клетки могут теперь быть продифференцированным от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), включая эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), последний создается путем перепрограммирования фибробластов кожи первичной от доноров16,17,18. Важно отметить, что самообновлению и плюрипотентности hPSCs обеспечить надежный источник для генерации RPEs, в то время как пациент специфика hiPSCs и потенциал геномной модификации ЭСК (например, путем ТРИФОСФАТЫ) предлагают универсальная модель болезни в блюдо для желаемый BEST1 мутации.
hPSC НПП имеет ряд преимуществ над мышей НПП модели: 1) BEST1 нокаут мышей не отображать любые сетчатки аномалия19, повышение возможности различных генетических требование о BEST1 в НПП между мышей и людей; 2) только 3% клеток человека НПП binucleate, в отличие от 35% мышей20; 3) hiPSC НПП потенцирует аутологичной трансплантации в клинических лечения сетчатки расстройства21. Тем не менее Животные модели по-прежнему необходимы для изучения НПП физиологии и патологии в живой системе, и нельзя игнорировать онкогенных потенциал hiPSC.
Здесь описано, полезным и умеренно простой hPSC НПП дифференциация протокол, который может использоваться для научных исследований и клинических целей. Этот протокол использует никотинамид (витамин B3) для усиления дифференциации hPSCs в нервной ткани, который далее индуцируется дифференцироваться в НПП лечение с activin-A. Никотинамид лечение доказано увеличить количество пигментных клеток (знак дифференцировку в НПП), возможно путем ослабления деятельности apoptotic дифференциации клеток22. Результате клетки hPSC НПП отображения же ключевых маркеров, булыжник морфологии и клеточных функциональность как родной человеческие клетки НПП22. Таким образом в условиях исследований результате клетки hPSC НПП подходят для вниз по течению функционального анализа, включая immunoblotting, иммуноокрашивания и зажим поклеточного патч, для которых предоставляются подробные экспериментальные процедуры. Клинически НПП клетки, полученные из стволовых клеток показали большой потенциал для трансплантации лечения макулярной дегенерации в исследованиях на животных и человеческих испытаний23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Самой важной процедурой для болезни в блюдо подход является дифференцировать hPSCs с болезнетворные мутации в линии правильные ячейки, которая является НПП для BEST1. Таким образом после каждого эксперимента дифференциации, результате клетки hPSC НПП должно тщательно проверяться для и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался NIH грантов EY025290, GM127652 и Университет Рочестер начального финансирования.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
