Summary

भेदभाव, रखरखाव, और मानव रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं का विश्लेषण: एक रोग BEST1 उत्परिवर्तनों के लिए एक डिश मॉडल में

Published: August 24, 2018
doi:

Summary

यहाँ हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं असर रोगी-प्राप्त उत्परिवर्तनों से रेटिना वर्णक उपकला (RPE) कोशिकाओं अंतर करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. उत्परिवर्ती सेल लाइनों immunoblotting, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और पैच दबाना सहित कार्यात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस रोग में एक डिश दृष्टिकोण देशी मानव RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने की कठिनाई को दरकिनार ।

Abstract

हालांकि मानव BEST1 जीन में २०० से अधिक आनुवंशिक उत्परिवर्तनों की पहचान की गई है और रेटिना अपक्षयी रोगों से जुड़ा हुआ है, रोग तंत्र मुख्य रूप से BEST1 अध्ययन के लिए vivo मॉडल में एक अच्छा की कमी के कारण मायावी रह और शारीरिक स्थितियों के तहत अपने उत्परिवर्तनों । BEST1 encodes एक आयन चैनल, अर्थात् BESTROPHIN1 (BEST1), जो रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में कार्य करता है; हालांकि, देशी मानव RPE कोशिकाओं के लिए अत्यंत सीमित पहुंच वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक बड़ी चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानव RPEs असर BEST1 रोग उत्पंन करने के लिए-मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) से प्रेरित भेदभाव के कारण उत्परिवर्तनों । के रूप में hPSCs आत्म अक्षय हैं, इस दृष्टिकोण शोधकर्ताओं hPSC के एक स्थिर स्रोत के लिए विभिंन प्रायोगिक विश्लेषण के लिए RPEs, जैसे immunoblotting, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, और पैच दबाना है, और इस तरह एक बहुत शक्तिशाली रोग प्रदान करता है के लिए अनुमति देता है एक डिश के लिए मॉडल BEST1-जुड़े रेटिना की स्थिति । विशेष रूप से, इस रणनीति RPE (पैथो) फिजियोलॉजी और ब्याज के अंय जीन natively RPE में व्यक्त अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

यह प्रलेखित किया गया है कि BEST1 जीन1,2,3,4,5,6 में आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण कम से कम पांच रेटिना अपक्षयी रोग हैं , 7 , 8, पहले से ही २०० से अधिक की सूचना उत्परिवर्तनों की संख्या के साथ और अभी भी बढ़ रही है । इन BEST1-जुड़े रोगों, भी bestrophinopathies के रूप में जाना जाता है, प्रगतिशील दृष्टि हानि और भी अंधापन का कारण है, और वहां वर्तमान में कोई प्रभावी उपचार कर रहे हैं । BEST1के प्रोटीन उत्पाद अर्थात् BESTROPHIN1 (BEST1), एक Ca2 +-सक्रिय सीएल चैनल (CaCC ) विशेष रूप से रेटिना वर्णक उपकला में व्यक्त (RPE) आंखों की5,6, 8,9. महत्वपूर्ण बात, BEST1-जुड़े रोगों के एक नैदानिक phenotype प्रकाश उत्तेजनाओं के लिए कम दृश्य प्रतिक्रिया है, प्रकाश चोटी (एल. पी.) कहा जाता है electrooculogram में मापा10,11; एल. पी. RPE12,13,14में एक CaCC द्वारा मध्यस्थता माना जाता है. आदेश में बेहतर BEST1 उत्परिवर्तनों के रोग तंत्र को समझने के लिए और संभावित चिकित्सा के लिए काम करने के लिए, यह उत्परिवर्ती BEST1 चैनल endogenously मानव RPE कोशिकाओं में व्यक्त अध्ययन करने के लिए आवश्यक है ।

हालांकि, सीधे जीवित रोगियों से RPE कोशिकाओं को प्राप्त करने के अत्यधिक अव्यावहारिक है । यद्यपि देशी RPE कोशिकाओं को मानव cadavers और भ्रूणों के बायोप्सी से काटा जा सकता है, इन स्रोतों के लिए कठिन पहुँच वैज्ञानिक अनुसंधान को काफी सीमित करता है. इसलिए, यह वैकल्पिक RPE मानव आंखों के अलावा अंय स्रोतों के लिए महत्वपूर्ण है । इस कॉल को स्टेम सेल तकनीक में हाल ही में प्रगति के द्वारा उत्तर दिया गया है, कार्यात्मक RPE कोशिकाओं के रूप में अब मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विभेदित किया जा सकता है (hPSCs), भ्रूण स्टेम सेल सहित (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs), बाद 16,17,18दानदाताओं से प्राथमिक त्वचा fibroblasts reprogramminging द्वारा उत्पंन किया जा रहा है । महत्वपूर्ण बात, स्व-नवीकरण और hPSCs के pluripotency RPEs उत्पन्न करने के लिए एक विश्वसनीय स्रोत सुनिश्चित करते हैं, जबकि जीनोमिक की hiPSCs और hESCs संशोधन क्षमता के रोगी-विशिष्टता (जैसे, CRISPR द्वारा) एक बहुमुखी रोग के लिए एक डिश मॉडल की पेशकश इि BEST1 उत्परिवर्तन ।

hPSC-RPE चूहों RPE मॉडल पर कई फायदे हैं: 1) BEST1 नॉकआउट चूहों किसी भी रेटिना विषमता19प्रदर्शित नहीं करते हैं, चूहों और मनुष्यों के बीच BEST1 में RPE के विभिन्न आनुवंशिक आवश्यकता की संभावना स्थापना; 2) मानव RPE कोशिकाओं के केवल 3% binucleate हैं, चूहों में ३५% के विपरीत20; 3) hiPSC-RPE potentiates रेटिना विकारों के नैदानिक उपचार में ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण21. फिर भी, पशु मॉडल एक जीवित प्रणाली में RPE फिजियोलॉजी और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अभी तक अपरिहार्य हैं, और hiPSC की oncogenic क्षमता की अनदेखी नहीं की जा सकती ।

प्रक्रिया यहां RPE भेदभाव प्रोटोकॉल है कि अनुसंधान और नैदानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक उपयोगी और मामूली सरल hPSC का वर्णन । इस प्रोटोकॉल nicotinamide (विटामिन B3) का उपयोग करता है तंत्रिका ऊतक, जो आगे activin के साथ उपचार द्वारा RPE में अंतर करने के लिए प्रेरित है के लिए hPSCs के भेदभाव को बढ़ाने के लिए । Nicotinamide उपचार pigmented कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है (RPE में भेदभाव का संकेत), संभवतः22कोशिकाओं अंतर की अपोप्तोटिक गतिविधि क्षीणन द्वारा. परिणामी hPSC-RPE कक्ष समान कुंजी मार्करों, cobblestone आकृति विज्ञान और सेलुलर कार्यक्षमता मूल मानव RPE कोशिकाओं22के रूप में प्रदर्शित करें । इस प्रकार, एक अनुसंधान की स्थापना में, जिसके परिणामस्वरूप hPSC-RPE कोशिकाओं immunoblotting, immunostaining सहित बहाव कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं, और पूरे सेल पैच दबाना, जिसके लिए विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं भी प्रदान की जाती हैं । नैदानिक, RPE कोशिकाओं स्टेम सेल से व्युत्पंन दोनों पशु अध्ययन और मानव परीक्षण23में धब्बेदार अध-पतन के प्रत्यारोपण उपचार के लिए महान क्षमता दिखाया गया है ।

Protocol

1. RPE को hPSC का विभेद बनाए रखने और पारित hPSCs के रूप में पहले18वर्णित है ।नोट: (hPSCs और hPSC सहित सभी कोशिकाओं-RPEs) वृद्धि और भेदभाव प्रोटोकॉल की अवधि के दौरान 5% CO2 में ३७ ° c में उगाया जाता है । भेदभ…

Representative Results

सबसे तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण कदम मैनुअल अलगाव, जो एक विभेदित पी0 hPSC-RPE जनसंख्या की एक उच्च शुद्धता प्राप्त करना है । एक सफल अलगाव के बाद, > P0 जनसंख्या में 90% कोशिकाओं बढ़ेगा और हस्ताक्?…

Discussion

रोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रक्रिया में एक डिश दृष्टिकोण एक रोग के साथ hPSCs अंतर करने के लिए सही कोशिका वंश है, जो BEST1के लिए RPE है उत्परिवर्तन के कारण है । इस प्रकार, प्रत्येक भेदभाव प्रयोग के बाद, परिणाम?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस परियोजना NIH अनुदान EY025290, GM127652 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और रोचेस्टर शुरू की वित्त पोषण विश्वविद्यालय ।

Materials

Knock-Out (KO) DMEM ThermoFisher 10829018
KO serum replacement ThermoFisher 10829028
Nonessential amino acids ThermoFisher 11140050
Glutamine ThermoFisher 35050061
Penicillin-streptomycin ThermoFisher 10378016
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Human activin-A PeproTech 120-14
MEM (a modification) Sigma-Aldrich M4526
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
N1 supplement Sigma-Aldrich N6530
Glutamine-penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich G1146
Nonessential amino acids Sigma-Aldrich M7156
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H0386
Triiodo-thyronin Sigma-Aldrich T5516
mTeSR-1 medium Stemcell Technologies 5850
Matrigel Corning 356230
Collagenase Gibco 17104019
Trypsin VWR 45000-664
M-PER mammalian protein extraction reagent Pierce 78501
proteinase inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 4693159001
RPE65 antibody Novus Biologicals NB100-355
CRALBP antibody Abcam ab15051
BEST1 antibody Novus Biologicals NB300-164
Beta Actin antibody ThermoFisher MA5-15739
Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG ThermoFisher A-21202
Goat anti-mouse IgG ThermoFisher SA5-35521
Goat anti-Rabbit IgG LI-COR Biosciences 926-68071
Hoechst 33342 ThermoFisher 62249
HEKA EPC10 patch clamp amplifier Warner Instruments 895000
Patchmaster Warner Instruments 895040

References

  1. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
  2. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
  3. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
  4. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
  5. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
  6. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
  7. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
  8. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
  9. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  10. Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
  11. Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
  12. Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
  13. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
  14. Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
  15. Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
  16. Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
  17. Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
  18. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
  19. Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
  20. Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
  21. Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
  22. Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
  23. Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
  24. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  25. Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
  26. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
  27. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
  28. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
  29. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
  30. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
  31. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  32. Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
  33. Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).

Play Video

Cite This Article
Kittredge, A., Ji, C., Zhang , Y., Yang, T. Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations. J. Vis. Exp. (138), e57791, doi:10.3791/57791 (2018).

View Video