Summary

Fare ve insan elde edilen birincil Gastrik epitel Monolayer kültür yenilenme çalışmaları için

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

Burada biz kurmak ve 3 boyutlu (3D) Gastrik organoids insan ve fare türetilen ve yöntemi 3D organoids aktarmak için bir 2-boyutlu monolayer kültür bir protokol tanımlamak. Yenilenme çalışmaları bir roman çizik-yara tahlil olarak Gastrik epitel monolayer kullanımı da açıklanmıştır.

Abstract

Vitro çalışmalar, mide yarası onarma genelde mide kanseri hücre hatlarında bir çizik-yara tahlil hücresel proliferasyonu ve göç kullanımını içerir. Bir kritik böyle deneyleri, ancak, onların homojen karışım-in hücresel türleri kısıtlamasıdır. Onarım birkaç hücre tipleri arasındaki etkileşimin talepleri karmaşık bir süreçtir. Bu nedenle, bir kültür hücresel alt türlerinden yoksun çalışmaya Eğer biz onarım süreci anlamak için aşılması gereken bir sorundur. Mide organoid modeli mademki türdeş olmayan hücre türleri topluluğu benzer biçimde, Gastrik epitel veya diğer yerel doku içinde vivoyansıtan bu sorunu hafifletmek. İşte bir roman, insan türetilmiş vitro çizik-yara tahlil gösterdi veya sonra bir Gastrik epitel monolayer sağlam ya organoids ya da bir tek hücre süspansiyon olarak transfer edilebilir fare 3 boyutlu organoids ayrışmış organoids. Gastrik yenilenme eğitim için bir roman çizik-yara tahlil sisteminde kullanılan organoid kaynaklı Gastrik epitel monolayers kurmak için protokol hedefidir.

Introduction

Çizik-yara deneyleri kullanımı onarım ve rejenerasyon1,2,3,4,5,6eğitim için popüler bir yöntemdir. Önerilen metodoloji özellikle mide yenilenme ve Helicobacter pylori kolonizasyon eğitim için kullanılabilir. Geçmişte, mide kanseri hücre hatları Helicobacter pylori (H. pylori) enfeksiyon1,2 çalışma için bir araç olarak kullanılmış olan ve ana kadar son zamanlarda mide kanseri hücre hatları AGS hücreleri gibi tercih1 vardı. ,2,3,4. Bir mide kanseri hücre kültürleri Gastrik epitel hücre çeşitliliği özetlemek için onların başarısızlığı kısıtlamasıdır. Bu sınırlama, adres deneyin için işte kuruluş ve birincil insan ve fare-kaynaklı 3 boyutlu fundic mide organoids (FGOs) transferi için değiştirilmiş bir yöntemiyle ilk alan yara iyileşme deneyleri için Gastrik epitel monolayer gösterdi Schlaermann ve arktarafından açıklanan. 7 biz Gastrik epitel monolayers türetilen güdülmesini 3D Gastrik FGOs veya tek hücre FGO elde tutmak yakından bu Gastrik epitel temsil eden bir polarize hücresel kompozisyon göstermek içinde vivo. Mide kanseri hücre hatları bu teknik görüntüler hücre kompozisyon göstermek değil ki, geçerli protokol alternatif çizik-yara tahlil yöntemleri üzerinde bir avantaj sahiptir. Monolayers bütün organoids veya tek hücre süspansiyon Disosiye organoids üzerinden kurulan ve kaplama bir membran matrisi kullanarak veya kollajen-kaplama olabilir mademki bu metodoloji optimize edilmiştir. Bu iletişim kuralı genel amacı bir organoid Gastrik epitel monolayer kültürler bir roman yara iyileşme tahlil için türetilmiş kurmaktır.

Protocol

Kirlenmesini önlemek için iletişim kuralı bütünüyle bir steril doku kültürü başlık içinde gerçekleştirin. İnsan fundic doku kol gastrektomi onaylı Cincinnati Üniversitesi IRB protokolüne göre geçiren hastaların toplanan (IRB protokol numarası: 2015-4869).Tüm fare çalışmaları Cincinnati Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi (IACUC) bir Amerikan Derneği değerlendirme ve Akreditasyon, laboratuvar hayvan bakım (AAALAC) tesis tutar tarafından kabul edildi. <p cl…

Representative Results

Organoids ya corpus/vücut insan ya da fundus fare mide dokuların (şekil 1A) elde edilmiştir. Ya collagenase ya da EDTA sindirim mide dokusunun insan veya fare türetilmiş sonra sırasıyla, bezleri membran matris gömülü ve 6-7 gün (şekil 1A) kültürlü. Şekil 1B sonra Gastrik epitel monolayer (huGEM) için membran matris kaplı odası slaytlarda transfer edilmiş insan kaynaklı mide orga…

Discussion

Geçerli protokol çizik-yara deneyleri için kullanılan insan ve fare türetilmiş Gastrik epitel monolayers kurulması ayrıntıları. Değiştirilmiş bir protokol ilk Schlaermann ve ark7tarafından yayınlanan ve protokol ikamet kök hücre izolasyon birincil insan (veya fare) doku kavramı üzerinde bağlıdır. Özellikle, biz burada protokolü bir birleşmesi kurmak için optimize edilmiş ve hangi ifade eder ve ana hücre içinde Gastrik epitel vivo içindebulunan soy Ga…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NIH (NIDDK) 5 desteklenmiştir R01 DK083402-07 (YZ) verin.

Materials

Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) Life Technologies 12634-010
GlutaMAX (L-glutamine) Life Technologies 25030-081
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Amphotericin B/Gentamicin Thermo Scientific R01510
Kanamycin Thermo Fisher RO1510
HEPES Buffer Sigma Aldrich H0887
n-Acetylcystine Sigma Aldrich A9165
N2 Life Technologies 17502-048
B27 Life Technologies 12587-010
BMP Inhibitor (Noggin) Pepro Tech 250-38
Gastrin Tocris 3006
EGF Pepro Tech 315-09
FGF10 Pepro Tech 100-26
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Y-27632 ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TGF-β Inhibitor Tocris 2939
Ca2+/Mg2+ -free DPBS Fisher 21-031CV
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum FBS
OPTIMEM Invitrogen
0.22µM filter Fisher 099-720-004
37 °C Water Bath
Collagenase Type 1 Worthington  LS004214
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
Kimwipes (tissue paper) Fischer Scientific 06-666C
125 mL round bottom flask
1 in (25 mm) stir bar
Rubber Septa
Sterile Gauze
Stir Plate
Ring Stand
Ring Stand Clamps
Sterile petri dish
18 G needles of 1.5 in length Thermo Fisher 305196
20 G spinal needles of 3.5 in length Thermo Fisher 405182
12-well cell culture treated plate Midwest Scientific 92012
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) Fisher CB-40230C
Sterile Razor Blades
Wide-tip tweezers
Curved Hemostatic Forceps
200 µL wide pipette tips Thermo Fisher 02-707-134
5 mL cell culture test tubes Fisher 14-956-3C
Oxygen Tank with rubber hosing
1 g D-Sorbitol
Sucrose Fisher SS-500
Dissecting microscope
Dissecting Tray
Rocking Table
Rat Tail Collagen Type 1 Life Technologies A10483-01
Cell culture grade glacial acetic acid Fisher A38-212
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
2-well chamber slide Thermo Fisher 155380
12-well Transwell (polyester membrane inserts) Corning 3460
Cell scraper Corning 353086
Accutase (cell detachment solution) Stemcell Technologies 7920
263/8 G syringe Thermo Fisher 309625
Razor blade
L Cells L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).   N/A
HEK-293T Rspondin secreting cells A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ).   N/A
HK-ATPase Primary Antibody Invitrogen SC-374094
E-Cadherinn SantaCruz sc-59778
UEA1 Sigma Aldrich L9006
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) ThermoFisher Scientific R37114

References

  1. Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
  2. Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
  4. Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
  5. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  6. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
  9. Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
  10. Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
  11. Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
  12. Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
  13. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
  14. Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).

Play Video

Cite This Article
Teal, E., Steele, N. G., Chakrabarti, J., Holokai, L., Zavros, Y. Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57435, doi:10.3791/57435 (2018).

View Video