Summary

중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생

Published: May 07, 2018
doi:

Summary

여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.

Abstract

위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.

Introduction

처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 하 시연 설립 및 기본 인간 및 마우스 파생 3 차원 fundic 위 organoids (FGOs)의 이동은 여기 먼저 수정 된 방법에 따라 상처 치유 분석 실험에 대 한 위 상피 단층을 Schlaermann 외에의해 설명. 7 위 상피 monolayers에서 파생 된 전단 3D 위 FGOs 또는 단일 셀 FGO 파생 된 유지 밀접 하 게 위 상피의 나타내는 편광된 세포 구성 시연 vivo에서. 위 암 셀 라인 팬 들은이 기술을 표시 셀 구성의 정보를 입증 하지 않습니다, 그는 현재 프로토콜 대체 스크래치 상처 분석 방법에 비해 장점이 있다. 이 방법론은 해리 organoids에서 단일 세포 현 탁 액 또는 전체 organoids에서 설립 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 도금 또는 콜라겐 코팅 monolayers 수 면 최적화 되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 organoid 파생 된 위 상피 단층 문화 소설 상처 치유 분석 결과 대 한 설정입니다.

Protocol

오염 방지, 살 균 조직 문화 후드 내에서 전체 프로토콜을 수행 합니다. 승인 된 신시내티 대학 IRB 프로토콜에 따라 소매 위절제술을 받은 환자에서 인간의 fundic 조직 수집 (IRB 프로토콜 번호: 2015-4869).모든 마우스 연구는 신시내티 대학 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 평가의 미국 협회 및 인증의 실험실 동물 배려 (AAALAC) 시설 유지 관리에 의해 승인 되었다. 1. 인간 파생…

Representative Results

Organoids는 인간의 코 퍼스/본문 또는 마우스 위 조직 (그림 1A)의 저에서 파생 되었다. 콜라 또는 인간 또는 마우스 파생 된 위장 조직의 EDTA 소화 후 각각 샘 지하실 멤브레인 매트릭스에 포함 되며 6-7 일 (그림 1A)에 대 한 교양. 그림 1B 인간 파생 위 organoids (huFGOs) 다음 위 상피 단층 (huGEM)로 지하실 멤브레인 …

Discussion

현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).

Materials

Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) Life Technologies 12634-010
GlutaMAX (L-glutamine) Life Technologies 25030-081
Penicillin/Streptomycin Thermo Scientific SV30010
Amphotericin B/Gentamicin Thermo Scientific R01510
Kanamycin Thermo Fisher RO1510
HEPES Buffer Sigma Aldrich H0887
n-Acetylcystine Sigma Aldrich A9165
N2 Life Technologies 17502-048
B27 Life Technologies 12587-010
BMP Inhibitor (Noggin) Pepro Tech 250-38
Gastrin Tocris 3006
EGF Pepro Tech 315-09
FGF10 Pepro Tech 100-26
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636
Y-27632 ROCK Inhibitor Sigma Aldrich Y0503
TGF-β Inhibitor Tocris 2939
Ca2+/Mg2+ -free DPBS Fisher 21-031CV
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 12634-010
Fetal Bovine Serum FBS
OPTIMEM Invitrogen
0.22µM filter Fisher 099-720-004
37 °C Water Bath
Collagenase Type 1 Worthington  LS004214
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418
Kimwipes (tissue paper) Fischer Scientific 06-666C
125 mL round bottom flask
1 in (25 mm) stir bar
Rubber Septa
Sterile Gauze
Stir Plate
Ring Stand
Ring Stand Clamps
Sterile petri dish
18 G needles of 1.5 in length Thermo Fisher 305196
20 G spinal needles of 3.5 in length Thermo Fisher 405182
12-well cell culture treated plate Midwest Scientific 92012
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) Fisher CB-40230C
Sterile Razor Blades
Wide-tip tweezers
Curved Hemostatic Forceps
200 µL wide pipette tips Thermo Fisher 02-707-134
5 mL cell culture test tubes Fisher 14-956-3C
Oxygen Tank with rubber hosing
1 g D-Sorbitol
Sucrose Fisher SS-500
Dissecting microscope
Dissecting Tray
Rocking Table
Rat Tail Collagen Type 1 Life Technologies A10483-01
Cell culture grade glacial acetic acid Fisher A38-212
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
2-well chamber slide Thermo Fisher 155380
12-well Transwell (polyester membrane inserts) Corning 3460
Cell scraper Corning 353086
Accutase (cell detachment solution) Stemcell Technologies 7920
263/8 G syringe Thermo Fisher 309625
Razor blade
L Cells L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands).   N/A
HEK-293T Rspondin secreting cells A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ).   N/A
HK-ATPase Primary Antibody Invitrogen SC-374094
E-Cadherinn SantaCruz sc-59778
UEA1 Sigma Aldrich L9006
Hoechst 33342 Thermo Fisher H3570
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) ThermoFisher Scientific R37114

References

  1. Nagy, T. A., et al. Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling. J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).
  2. Mnich, E., et al. Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier. World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).
  3. Zhang, Y., et al. Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing. Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).
  4. Crabtree, J. Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage. Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).
  5. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  6. Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model. Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation. PLoS Pathog. 11 (2), e1004663 (2015).
  9. Tarnawski, A. S. Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing. Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).
  10. Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells. Nature. 343, 82-85 (1990).
  11. Wright, C. L., Riddell, R. H. Histology of the stomach and duodenum in Crohn’s disease. Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).
  12. Engevik, A. C., et al. The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach. CMGH. , (2016).
  13. Bertaux-Skeirik, N., et al. CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium. Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).
  14. Nam, K. T., et al. Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach. Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).

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Cite This Article
Teal, E., Steele, N. G., Chakrabarti, J., Holokai, L., Zavros, Y. Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration. J. Vis. Exp. (135), e57435, doi:10.3791/57435 (2018).

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