Summary

Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

Published: April 20, 2018
doi:

Summary

Здесь мы приводим простой и недорогой Серебряный пятнать протокол, который требует только три реагентов и 7 минут обработки и подходит для быстрого поколения высокого качества данных ССР в генетический анализ.

Abstract

Просто повторить последовательность (ССР) является одним из наиболее эффективных маркеров, используемые в растительных и животных генетических исследований и молекулярных селекционных программ. Серебряный пятнать это широко используемый метод для обнаружения маркеров ССР в геле полиакриламида. Однако обычные протоколы для Серебряные пятная технически сложных и трудоемких. Как многие другие биологические лаборатории методики, Серебряные пятная протоколы неуклонно оптимизирован для повышения эффективности обнаружения. Здесь мы приводим упрощенная Серебряный пятнать метод, который существенно снижает затраты реагента и обнаружения резолюции и картина усиливает. Новый метод требует два важных шага (пропитка и развития) и три реагентов (нитрата серебра, гидроксид натрия и формальдегид) и только в 7 мин обработки для не Денатурирующий гель полиакриламида. По сравнению с ранее сообщалось протоколов, этот новый метод проще, быстрее и использует меньше химических реагентов для обнаружения ССР. Таким образом этот простых, недорогостоящих и эффективных Серебряный пятнать протокол выиграют генетическое картирование и селекции Селекция с помощью маркеров путем быстрого поколения ССР маркер данных.

Introduction

Развитие на основе ПЦР маркеров революционизировало наука генетики растений и разведения1. Среди наиболее часто используемые и наиболее универсальным ДНК маркеров простой последовательности повторить (ССР) маркеры. Их генома широкое освещение, изобилие, специфика генома и повторяемости являются некоторые из достоинств ССР маркеров в дополнение к их кодоминантного наследования для обнаружения гетерозиготных генотипов2. Несколько исследований использовали ССР маркеры для изучения генетического разнообразия, отслеживать родословную, построить генетическая связь карт и карта гены для экономически важных черт3,4.

Продукты PCR маркеров SSR обычно разделяются с помощью электрофореза агарозы или геля полиакриламида и затем визуализируется с Серебряный пятнать или под УФ света после окрашивания бромидом ethidium. Серебряный пятнать фрагментов ДНК в полиакриламидных гелей более чувствительны, чем другие пятная методы5,6 и широко используется для обнаружения фрагментов ДНК как ССР маркеры7.

Как много методов биологической лаборатории серебро Окрашивание акриламидных гелей неуклонно улучшилось после ее первых сообщанными как метод визуализации фрагмента в 1979 году8. Техника первоначально была изменена для обнаружения фрагментов ДНК Бассам и др. 6 в 1991 году и затем улучшить Сангинетти и coworkers9 в 1994 году. Метод был оптимизирован в последние несколько десятилетий6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Однако, большинство этих обновленных версий протоколов до сих пор некоторые недостатки, такие как высокий спрос технических и долго время для фиксации обработки и монтажа6, которые ограничивают применение этих протоколов7, 11. Это оптимальный протокол, который сочетает в себе лоу кост с высокой эффективностью обнаружения фрагментов ДНК срочно необходима для обычного применения Серебряный пятнать в биологических исследованиях.

Кроме того гель полиакриламида можно подразделить денатурируя и не денатурации полиакриламидные гели, и оба могут быть использованы для обнаружения маркеров SSR с помощью Серебряный пятнать метод. Эффект и разрешение которых существенно не отличается, но не денатурации полиакриламидных гелей проще процесс и занять меньше времени16.

На основе предыдущих исследований15целью настоящего исследования является описать оптимизированный Серебряный пятнать протокол в деталях для быстро, просто и лоу кост обнаружения маркеров SSR-Денатурирующий гель полиакриламида.

Protocol

1. Подготовка продуктов ПЦР маркеров SSR Подготовка всех химических веществ и реактивов для ПЦР-реакции, включая шаблон ДНК (30 нг/мкл), 2 × ПЦР главный микс (содержащие 2 × буфер ПЦР, 0,4 мм каждого dNTP, 3 мм MgCl2, 0.1 U/мкл полимеразы дна Taq и красители), 10 мкм каждого вперед и назад грунтовк…

Representative Results

Ампликонов PCR были произведены с использованием соответствующих пар грунтовка ССР в цветущий китайская капуста и табак. После электрофореза полиакриламидные гели были пятнами, с использованием выше Серебряный пятнать протокол, который однозначно обнаружен диапазон…

Discussion

Стиральной гель после пропитки является важным шагом. Объем времени и воды недостаточно Стиральная может привести к неполному удалению пропитки решения на поверхности пластины и гель и привести в темном фоне. Соответствующее время развивающихся является еще одним ключевым шагом, чре?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась фонд естественных наук Гуандун Китая (2015A030313500), провинциальные ключ международного кооперативного исследовательская платформа и крупные научно исследовательский проект Гуандун высшего образования (2015KGJHZ015), Наука и Технология план администрации монополии табака Гуандун (201403, 201705), науки и технологии план Гуандун Китая (2016B020201001), национальной инновационной учебного проекта для студентов (201711078001). Упоминание названия торговых или коммерческих продуктов в данной публикации исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения Министерством сельского хозяйства. USDA — равных возможностей поставщика и работодателем.

Materials

PCR master mix (Green Taq Mix) Vazyme Biotech Co. Ltd, China #P131-03
50-2000 bp DNA Ladder Bio-Rad, USA #170-8200
DL500 DNA marker Takara Bio Inc., Japan #3590A
Tris base Sangon Biotech Shanghai, China #77-86-1
Boric acid Sangon Biotech Shanghai, China #10043-35-3
EDTA-Na2 Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #6381-92-6
Acrylamide Sangon Biotech Shanghai, China #79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide Sangon Biotech Shanghai, China #110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine Sangon Biotech Shanghai, China #110-18-9
Ammonium persulfate Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #7727-54-0
Bind-silane Solarbio Beijing, China #B8150
AgNO3 Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China #7761-88-8
Formaldehyde Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China #50-00-0
NaOH Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #1310-73-2
Acetic acid Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #64-19-7
Na2CO3 Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China #497-19-8
Ethanol Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #64-17-5
HNO3 Guangzhou Chemical Reagent Factory, China #7697-37-2
Na2S2O3.5H2O Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China #10102-17-7
Eriochrome black T(EBT) Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China #1787-61-7
Plastic tray Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China
TS-1 Shaker Qilinbeter JiangSu, China
BenQ M800 Scanner BenQ, China
DYY-6C Power supply Beijing Liuyi Instrument Factory, China
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China

References

  1. Jiang, G. L., Anderson, S. B. Molecular markers and marker-assisted breeding in plants. Plant breeding from laboratories to fields. , 45-83 (2013).
  2. Powell, W., Machray, G. C., Provan, J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trend Plant Sci. 1, 215-222 (1996).
  3. Varshney, R. K., Graner, A., Sorrells, M. E. Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotechnol. 23, 48-55 (2005).
  4. Tuler, A. C., Carrijo, T. T., Nóia, L. R., Ferreira, A., Peixoto, A. L., da Silva Ferreira, M. F. SSR markers: a tool for species identification in Psidium (Myrtaceae). Mol. Biol. Rep. 42, 1501-1513 (2015).
  5. Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11, 785-794 (1990).
  6. Bassam, B. J., Caetano-Anollés, G., Gresshoff, P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 196, 80-83 (1991).
  7. Liang, Q., et al. A rapid and effective method for silver staining of PCR products separated in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 35, 2520-2523 (2014).
  8. Switzer, R. C., Merril, C. R., Shifrin, S. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 98, 231-237 (1979).
  9. Sanguinetti, C., Dias, N., Simpson, A. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Biotechniques. 17, 915-919 (1994).
  10. Ji, Y., Qu, C., Cao, B. An optimal method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 28, 1173-1175 (2007).
  11. Qu, L., Li, X., Wu, G., Yang, N. Efficient and sensitive method of DNA silver staining in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 26, 99-101 (2005).
  12. An, Z., et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment. Anal. Biochem. 391, 77-79 (2009).
  13. Byun, S. O., Fang, Q., Zhou, H., Hickford, J. G. H. An effective method for silver-staining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Anal. Biochem. 385, 174-175 (2009).
  14. Kumar, M., Kim, S. R., Sharma, P. C., Pareek, A. Simple and efficient way to detect small polymorphic bands in plants. Genome Data. 5, 218-222 (2015).
  15. Liu, W., et al. Development of a simple and effective silver staining protocol for detection of DNA fragments. Electrophoresis. 38, 1175-1178 (2017).
  16. Wang, D., Shi, J., Carlson, S. R., Cregan, P. B., Ward, R. W., Diers, B. W. A low-cost, high-throughput polyacrylamide gel electrophoresis system for genotyping with microsatellite DNA markers. Crop Sci. 43, 1828-1832 (2003).
  17. Echt, C. S., May-Marquardt, P., Hseih, M., Zahorchak, R. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome. 39, 1102-1108 (1996).

Play Video

Cite This Article
Huang, L., Deng, X., Li, R., Xia, Y., Bai, G., Siddique, K. H., Guo, P. A Fast Silver Staining Protocol Enabling Simple and Efficient Detection of SSR Markers using a Non-denaturing Polyacrylamide Gel. J. Vis. Exp. (134), e57192, doi:10.3791/57192 (2018).

View Video