Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants
Summary
Nous rapportons ici un protocole qui nécessite seulement trois réactifs et 7 min de traitement et est adapté pour la Géneration rapide des données de SSR de qualité dans l’analyse génétique de coloration à l’argent simple et peu coûteuse.
Abstract
Simple Sequence Repeat (SSR) est un des marqueurs plus efficaces utilisés dans la recherche en génétique animale et végétale et des programmes de sélection moléculaire. Coloration à l’argent est une méthode largement utilisée pour la détection des marqueurs dans un gel de polyacrylamide. Cependant, les protocoles classiques coloration à l’argent sont techniquement exigeants et chronophage. Comme de nombreux autres laboratoires biologiques techniques, protocoles de coloration à l’argent ont été constamment optimisés pour améliorer l’efficacité de la détection. Nous rapportons ici une coloration méthode significativement réduit les coûts de réactif et améliore la clarté de la résolution et la photo de détection simplifié à l’argent. La nouvelle méthode nécessite deux étapes principales (imprégnation et développement) et trois réactifs (nitrate d’argent, d’hydroxyde de sodium et formaldéhyde) et seulement 7 min de traitement pour un gel de polyacrylamide non dénaturant. Par rapport aux protocoles indiqués précédemment, cette nouvelle méthode est plus facile, plus rapide et utilise moins de réactifs chimiques pour la détection de la SSR. Par conséquent, ce protocole de coloration à l’argent simple, peu coûteux et efficace bénéficiera de cartographie génétique et la sélection assistée par une génération rapide de données marqueur SSR.
Introduction
Le développement de marqueurs PCR a révolutionné la science de la génétique des plantes et reproduction1. Marqueurs microsatellites (SSR) sont parmi les marqueurs d’ADN plus polyvalents et les plus couramment utilisés. Leur génome large couverture, abondance, spécificité du génome et répétabilité sont quelques-uns des mérites des microsatellites en plus de leur héritage codominant pour la détection des hétérozygotes génotypes2. Plusieurs études ont utilisé des microsatellites pour étudier la diversité génétique, suivre ascendance, établir des cartes de liaison génétique et cartographier les gènes pour les caractères économiquement importants3,4.
Produits PCR des microsatellites sont couramment séparés par électrophorèse sur agarose ou gel de polyacrylamide et puis visualisées avec coloration à l’argent ou sous une lumière UV après coloration au bromure d’éthidium. Coloration à l’argent de fragments d’ADN en gels de polyacrylamide est plus sensible que les autres coloration méthodes5,6 et a été largement utilisée pour détecter des fragments d’ADN comme marqueurs SSR7.
Comme de nombreuses techniques de laboratoire d’analyses biologiques, coloration à l’argent des gels de polyacrylamide a augmenté depuis son tout d’abord rapporté qu’une technique de visualisation de fragment dans 19798. La technique a été initialement modifiée pour la détection de fragments d’ADN par Bassam al. 6 en 1991 et ensuite amélioré par Sanguinetti et collaborateurs9 en 1994. La méthode a été optimisée en dernier quelques décennies6,7,9,10,11,12,13,14 , 15. Toutefois, la plupart de ces versions mises à jour des protocoles ont encore quelques inconvénients tels que la forte demande technique et long temps pour fixation de traitement et montage6, qui limitent l’application de ces protocoles7, 11. Un protocole optimal qui allie faible coût avec le rendement élevé de détection de fragment d’ADN est absolument nécessaire pour l’application systématique de coloration dans la recherche biologique à l’argent.
En outre, gel de polyacrylamide peuvent être divisée en dénaturants et non-dénaturisation de gels de polyacrylamide, et les deux peuvent être utilisés pour la détection des marqueurs à l’aide de la méthode de coloration à l’argent. L’effet et la résolution qui ne diffèrent pas significativement, mais non-dénaturisation de gels de polyacrylamide sont plus faciles à traiter et prendre moins de temps16.
Sur la base de la recherche précédente15, l’objectif de la présente étude est de décrire une coloration protocole en détail pour la détection rapide, facile et peu coûteux des microsatellites dans un gel de polyacrylamide non dénaturants optimisée à l’argent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le lavage de gel après l’imprégnation est une étape cruciale. Volume de l’eau et le temps lavage insuffisant pourrait l’élimination incomplète des solution d’imprégnation sur la surface de la plaque et le gel et provoquer dans un fond sombre. Le temps de développement approprié est une autre étape clé, développement excessif peut se traduire par un fond brun foncé avec une image de faible contraste de fragments d’ADN. En outre, l’étape d’imprégnation altèrent l’efficacité coloration des fr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la Fondation de sciences naturelles de Chine Guangdong (2015A030313500), la plateforme de recherche clé International coopérative provinciale et les grands scientifiques recherche projet de Guangdong l’enseignement supérieur (2015KGJHZ015), la Science et Plan de la technologie du Guangdong Tobacco Monopoly Administration (201403, 201705), Science et technologie Plan de Guangdong de la Chine (2016B020201001), le projet de formation National d’Innovation pour les étudiants de premier cycle (201711078001). La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cette publication est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le US Department of Agriculture. USDA est un fournisseur de l’égalité des chances et l’employeur.
Materials
| PCR master mix (Green Taq Mix) | Vazyme Biotech Co. Ltd, China | #P131-03 | |
| 50-2000 bp DNA Ladder | Bio-Rad, USA | #170-8200 | |
| DL500 DNA marker | Takara Bio Inc., Japan | #3590A | |
| Tris base | Sangon Biotech Shanghai, China | #77-86-1 | |
| Boric acid | Sangon Biotech Shanghai, China | #10043-35-3 | |
| EDTA-Na2 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #6381-92-6 | |
| Acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #79-06-1 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-26-9 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sangon Biotech Shanghai, China | #110-18-9 | |
| Ammonium persulfate | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7727-54-0 | |
| Bind-silane | Solarbio Beijing, China | #B8150 | |
| AgNO3 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #7761-88-8 | |
| Formaldehyde | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #50-00-0 | |
| NaOH | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #1310-73-2 | |
| Acetic acid | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-19-7 | |
| Na2CO3 | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #497-19-8 | |
| Ethanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #64-17-5 | |
| HNO3 | Guangzhou Chemical Reagent Factory, China | #7697-37-2 | |
| Na2S2O3.5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China | #10102-17-7 | |
| Eriochrome black T(EBT) | Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China | #1787-61-7 | |
| Plastic tray | Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China | – | |
| TS-1 Shaker | Qilinbeter JiangSu, China | – | |
| BenQ M800 Scanner | BenQ, China | – | |
| DYY-6C Power supply | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | – | |
| High throughout vertical gel systems, JY-SCZF | Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China | – |
References
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