Summary

Isolation von dendritischen Zellen aus menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für phänotypische und funktionelle Studien

Published: March 13, 2018
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Summary

Wir beschreiben hier eine Methode um zu isolieren und reinigen von dendritischen Zellen aus verschiedenen anatomischen Fächer in der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane für die Bewertung ihrer phänotypischen und funktionellen Eigenschaften. Diese Methode kann zu anderen Immunzellen oder dendritische Zellen aus anderen Schleimhaut-Gewebe isolieren angepasst werden.

Abstract

Die Charakterisierung der menschlichen dendritischen Zellen (DCs) Wohnsitz in Schleimhaut-Gewebe ist schwierig wegen der Schwierigkeiten bei der Beschaffung von Proben und die geringe Zahl von DCs pro Gewebe zu präsentieren. Doch wie der Phänotyp und die Funktion der DCs wird durch das Gewebe Umfeld geändert, ist es notwendig zu analysieren Gewebe Wohnbevölkerung DC, da Blut DCs nicht vollständig abgeleitet spiegeln die Komplexität des DCs in Geweben. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um DCs aus der menschlichen weiblichen Fortpflanzungsorgane (FRT) mit Hysterektomie zu isolieren, die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Das Protokoll besteht aus Gewebe Verdauung um eine einzelne Zelle gemischt Zellsuspension, gefolgt von positive magnetische Bead Auswahl zu generieren. Unsere Gewebe-Verdauung-Protokoll wird nicht Oberflächenmarker, cleave, wodurch phänotypische und funktionelle Analyse der DCs in der Steady-State, ohne Übernachtung Inkubationszeit oder Zelle Aktivierung. Dieses Protokoll kann für die Isolierung von anderen Immunzellen Typen oder Isolierung von DCs aus anderen Geweben angepasst werden.

Introduction

Die FRT hat die doppelte Funktion der Schutz gegen Krankheitserreger gleichzeitiger Implantation und Schwangerschaft1. Um dies zu erreichen, ist die FRT mit jeder anatomischen Region anzeigen histologischen, immunologische und funktionalen Besonderheiten1zersplittert.

DCs bei Schleimhaut-Oberflächen machen Kontakt mit Mikroben in der Lunge, Darm und Genitalbereich, und bieten Immunüberwachung für potenzielle Krankheitserreger2. DCs haben die einzigartige Fähigkeit, prime naive T-Zellen und adaptive Immunantworten3auslösen. DCs in der FRT sind auch darauf spezialisiert, um fremde Antigene, z. B. auf Sperma und den sich entwickelnden Fötus, ermöglichen erfolgreiche Schwangerschaft4zu dulden. Daher, je nach Standort, DC Phänotyp und Funktion deutlich werden. Es ist bekannt, dass DCs stark von der Gewebe beeinflusst sind, so dass ihre Anzahl, Phänotyp und Funktionen durch das Gewebe Umfeld geändert werden in denen sie3wohnen. Daher müssen um die Rolle zu verstehen, die FRT DCs bei ansteckenden Krankheiten, Schwangerschaft und Krebs in der FRT spielen, ansässige DCs zu untersuchenden abgeleiteten DC-Modelle nicht ausreichen sind, um die regulatorischen Komplexität in FRT Geweben gefunden zu adressieren, da Blut.

Die Charakterisierung des menschlichen Gewebes ansässige DCs ist schwierig, aufgrund der geringen Zahl von Zellen im Schleimhaut-Gewebe und die Schwierigkeit, die Erlangung menschlichen Gewebeproben. DCs sind untersucht worden, in der FRT mittels Immunhistochemie5,6, die informiert über die Zellenposition innerhalb des Gewebes, sondern schließt funktionelle Studien und beschränkt die Zahl der Identifizierung Zelle Marker, die analysiert werden können auf einmal. Darüber hinaus wurden einzelne Zelle isoliert Protokolle für durchflusszytometrischen Analyse entwickelten7,8,9. Einige dieser Protokolle nutzen die wandernden Kapazität des DCs, die Zellen zu isolieren, die migrieren. Diese Methoden in der Regel über Nacht Inkubationen und Auswahl der aktivierten DCs erfordern, aber lassen Sie nicht für das Studium der DCs in der Steady-State.

Hier, mit Hysterektomie, wir ein Protokoll, um DCs von verschiedenen anatomischen Standorten in den FRT der Gebärmutterschleimhaut (EM), isolieren optimiert die Endocervix (CX) und des Ectocervix (ECX), die phänotypische und funktionelle Analysen ermöglicht. Ein nicht-proteolytischen enzymatische Verdauung-Protokoll verwenden, können wir sofort nach Gewebe Verdauung zu Zelle isoliert und Flow durchflusszytometrischen Charakterisierung ohne Zellaktivierung fortfahren. Mit mehrfarbigen Durchflusszytometrie und Anpassung funktionelle Studien für eine geringe Anzahl von Zellen, wir erkennen und charakterisieren seltene Teilmengen von DCs in den verschiedenen Standorten der FRT

Protocol

Nach den Grundsätzen, die in der Deklaration von Helsinki zum Ausdruck gebracht wurden Studien am Menschen durchgeführt. Studien wurden vom Dartmouth College Institutional Review Board und dem Ausschuss für den Schutz der menschlichen Themen (CPHS) genehmigt. Schriftliche Einwilligung war HIV-negativ Frauen Hysterektomien am Dartmouth Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) vor der Operation entnommen. Ausgebildete Pathologen Gewebeproben aus der EM, CX und ECX, frei von pathologischen Läsionen und weit entfernt von d…

Representative Results

Folgende Gewebe Verdauung, die Freilassung von epithelialen Blätter und Drüsen kann beobachtet werden, wie in Figur 1Adargestellt; Dies ist eine positive Kontrolle, die angibt, dass die enzymatische Verdauung erfolgreich war. Die Anzahl der insgesamt vitaler Zellen und DCs pro Gramm Gewebe wiederhergestellt werden auch in Abbildung 1 b und Abbildung 1, bzw. angezeigt. Immunzellen sind zwischen 5-30…

Discussion

Schleimhaut DCs sind eine seltene Zellpopulation stark beeinflusst durch die Gewebe-Umgebung, die deren Phänotyp und Funktion ändert, sobald sie das Gewebe3geben Sie. Während Blut abgeleitet DCs sind ein sehr nützliches Modell, sie repräsentieren nicht voll die Vielfalt der DC-Populationen in Geweben gefunden. Deshalb, um die einzigartigen Eigenschaften der Schleimhaut DCs zu verstehen, ist Isolierung von Primärzellen von Gewebe notwendig. Isolierung von DCs von verschiedenen anatomischen St…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Studie von NIH unterstützt AI102838 und AI117739 (CRW) gewährt. Wir danken Richard Rossoll für technische Hilfe. Durchflusszytometrischen Analyse erfolgte in DartLab, die gemeinsame Ressource am Dartmouthsupported (P30CA023108-37) und (P30GM103415-15).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

References

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Cite This Article
Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

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