Summary

Isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor Phenotypical en functionele Studies

Published: March 13, 2018
doi:

Summary

Hier beschrijven we een methode om te isoleren en te zuiveren van dendritische cellen uit verschillende anatomische compartimenten in de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor de evaluatie van hun phenotypical en functionele kenmerken. Deze methode kan worden aangepast aan het isoleren van andere immune cellen of van dendritische cellen uit andere mucosal weefsels.

Abstract

De karakterisering van de menselijke dendritische cellen (DC’s) woonachtig in de mucosal weefsels is uitdagend als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, en de lage aantallen van DCs presenteren per weefsel. Nog, als de fenotype en de functie van DCs is gewijzigd door het weefsel milieu, er moet analyseren weefsel resident DC populaties, omdat bloed afkomstig DCs onvolledig weerspiegelen de complexiteit van DCs in weefsels. Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) met behulp van hysterectomie specimens waarmee zowel phenotypical en functionele analyses DCs. Het protocol bestaat uit weefsel spijsvertering voor het genereren van een eencellige gemengd celsuspensie, gevolgd door positieve magnetische kraal selectie. Ons weefsel spijsvertering protocol doet niet klieven oppervlakte markers, waardoor phenotypical en functionele analyse van DCs in de steady-state, zonder overnachting incubatie of cel activering. Dit protocol kan worden aangepast voor de isolatie van andersoortige immuun cel of isolatie van DCs uit andere weefsels.

Introduction

De FRT heeft de dubbele functie van de bescherming tegen ziekteverwekkers terwijl het toestaan van implantatie en zwangerschap1. Om dit te bereiken, is de FRT gecompartimenteerd, met elke anatomische regio unieke histologische, immunologische en functionele kenmerken1weer te geven.

DCs bijwonen mucosal oppervlakken maken contact met microben in de longen, de darmen en de voortplantingsorganen en immuun toezicht voor potentiële ziekteverwekkers2bieden. DCs hebben de unieke mogelijkheid om prime naïef T-cellen en adaptieve immuunresponsen3te activeren. DCs in de FRT zijn ook gespecialiseerd om het dulden van vreemde antigenen, zoals die gevonden in sperma en de zich ontwikkelende foetus, dat succesvolle zwangerschap4. Daarom, afhankelijk van de locatie, de DC fenotype en functie zal zijn verschillend. Het is bekend dat DCs sterk worden beïnvloed door het milieu weefsel, zodat hun aantal, fenotype en functies zijn gewijzigd door het milieu van de weefsels waarin zij3 wonen. Daarom, om te begrijpen van de rol die FRT DCs bij besmettelijke ziekten, zwangerschap, en kanker in de FRT spelen, resident DCs moeten worden bestudeerd, sinds bloed afgeleide DC modellen onvoldoende zijn om de regelgevende complexiteit gevonden in FRT weefsels.

De karakterisatie van menselijke weefsel resident DCs is uitdagend vanwege de lage aantallen cellen aanwezig in de mucosal weefsels en het moeilijk verkrijgen van menselijk weefselmonsters. DCs zijn bestudeerd in de FRT via immunohistochemistry5,6, die informeert over de cellocatie in het weefsel, maar verzet zich tegen de functionele studies, en die is beperkt in het aantal identificeren cel markeringen die kunnen worden geanalyseerd tegelijk. Bovendien zijn eencellige isolatie protocollen voor flow cytometrische analyse ontwikkelde7,8,9. Sommige van deze protocollen te profiteren van de trekkende capaciteit van DCs te isoleren van de cellen die migreren. Deze methoden meestal ‘s nachts incubations en selectie van geactiveerde DCs vereisen, maar laat niet voor de studie van DCs in de steady state.

Hier, met behulp van hysterectomie specimens, we geoptimaliseerd een protocol om te isoleren DCs van verschillende anatomische sites in de FRT, het endometrium (EM), de endocervix (CX), en de ectocervix (ECX), waarmee zowel de phenotypical en de functionele analyses. Een niet-Proteolytische enzymatische spijsvertering-protocol gebruikt, kunnen wij onmiddellijk na weefsel spijsvertering aan cel isolatie en stroom cytometrische karakterisering zonder activering van de cel. Multicolor stroom cytometry gebruikt en functionele studies voor de lage aantallen cellen aan te passen, kunnen we identificeren en karakteriseren van zeldzame deelverzamelingen van DCs in de verschillende sites van de FRT.

Protocol

Studies waarbij menselijke proefpersonen werden uitgevoerd volgens de beginselen die zijn uitgedrukt in de verklaring van Helsinki. Studies werden goedgekeurd door de Dartmouth College institutionele Review Board en de Commissie voor de bescherming van de menselijke onderwerpen (CPHS). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen HIV-negatieve vrouwen ondergaan operaties bij Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) voor de operatie. Opgeleide pathologen geselecteerd weefselmonsters van de EM CX en de E…

Representative Results

Volgende weefsel spijsvertering, de vrijlating van epitheliale bladen en klieren kan worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 1A; Dit is een positieve controle verschijnt dat de enzymatische vertering is voltooid. Het aantal totaal aantal levensvatbare cellen en DCs hersteld per gram weefsel worden ook weergegeven in figuur 1B en Figuur 1 c, respectievelijk. Immune cellen vertegenwoordigen tus…

Discussion

Mucosale DCs zijn een zeldzame celpopulatie sterk beïnvloed door het milieu weefsel, dat verandert hun fenotype en functie zodra ze de weefsels3invoert. Terwijl bloed afkomstig DCs zijn een handig model, ze doen niet geheel representatief is de diversiteit van DC populaties gevonden in weefsels. Daarom, om te begrijpen van de unieke kenmerken van mucosal DCs, isolatie van primaire cellen van weefsels is noodzakelijk. Isolatie van DCs van verschillende anatomische sites in de FRT biedt de mogelijk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ondersteund door de NIH studiebeurzen AI102838 en AI117739 (CRW). Wij danken Richard Rossoll voor technische bijstand. Flow cytometrische analyse werd uitgevoerd in DartLab, de gedeelde Resource Dartmouthsupported door (P30CA023108-37) en (P30GM103415-15).

Materials

Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Hyclone SH30015.03
Penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
HEPES (1M) Hyclone 15630-080
Collagenase IV Sigma C5138
Deoxyribonuclease I Worthington Biochemical LS002140
D-glucose Sigma Aldritch 50-99-7
0.22 um Stericup 500 mL  filter Millipore SCGPU05RE
100mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875712
150mm x 15mm polystyrene petri dish Fisherbrand FB0875714
150mm x 25mm polystyrene dish Corning 430599 Treated cell culture dish
Isotemp Incubator Fisher Scientific FICO3500TABB 5.0% CO2
American Rotator V American DADE R4140
250 um nylon mesh Sefar 03-250/50
20 um nylon mesh Sefar 03-20/14
Beckman GS-6R Centrifuge Beckman 358702
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L Lonza 04-418Q
Human AB Serum Valley Biomedical HP1022
Histopaque-1077 Sigma Aldritch 10771
Phosphate Buffer Solution (PBS) National Diagnostics CL-253 pH 7.4
Dead Cell Removal Kit Miltenyi Biotec 130-090-101
Pre-separation filter (30um) Miltenyi Biotec 130-041-407
LS column Miltenyi Biotec 130-042-410
Quadro MACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS multi-stand Miltenyi Biotec 130-042-303
EDTA USB 15694
CD1a Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-051-001
CD14 Microbeads, human Miltenyi Biotec 130-050-201
eFluor 670 cell proliferation dye eBiosciences 65-0840-85
96 well round bottom plate Falcon 9/8/2866
Zombie yellow viability dye Biolegend 423104
CD3 APC/Cy7, anti-human Tonbo Biosciences 25-0038-T100
CD4 PE, anti-human eBiosciences 12-0048-42
CD8a FITC, anti-human Tonbo Biosciences 35-0086-T100
Gallios Flow Cytometer Beckman Coulter Life Sciences B43618 10 color, VBR
MACSquant Analyzer 10 Miltenyi Biotec 130-096-343 8 color, VBR

References

  1. Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract. Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).
  2. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
  3. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  4. Tagliani, E., Erlebacher, A. Dendritic cell function at the maternal-fetal interface. Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).
  5. Kaldensjo, T., et al. Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection. PLoS One. 6 (6), e21344 (2011).
  6. Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).
  7. Ballweber, L., et al. Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells. J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).
  8. Hladik, F., et al. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).
  9. Duluc, D., et al. Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses. Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).
  10. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).
  11. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. J Vis Exp. (89), (2014).
  12. Givan, A. L., et al. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).
  13. Rodriguez-Garcia, M., et al. Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV. Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).
  14. Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract. Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).
  15. Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues. Am J Reprod Immunol. , (2017).

Play Video

Cite This Article
Rodriguez-Garcia, M., Fortier, J. M., Barr, F. D., Wira, C. R. Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies. J. Vis. Exp. (133), e57100, doi:10.3791/57100 (2018).

View Video