Summary

Recuperação de fluorescência zigóticos após o clareamento foto análise por frouxidão de cromatina que permite o desenvolvimento do termo

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

Frouxidão de cromatina parece estar envolvido no desenvolvimento potencial dos blastómeros. No entanto, não se sabe se a frouxidão de cromatina pode ser usado como um índice confiável para o potencial do desenvolvimento de embriões. Aqui, tem sido descrito um sistema experimental no qual zigotos de frouxidão-avaliada de cromatina podem desenvolver à gestação completa.

Abstract

Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese. Recentemente, frouxidão de cromatina ou abertura tem demonstrada ser envolvido no potencial de diferenciação celular de células-tronco embrionárias pluripotentes. Anteriormente foi relatado que em comparação com células-tronco embrionárias, zigotos abrigam uma estrutura extremamente afrouxada cromatina, sugerindo sua associação com sua totipotência. No entanto, até agora, isso não foi resolvido se essa estrutura extremamente solta/abrir cromatina é importante para o potencial do desenvolvimento embrionário. No presente estudo, para examinar esta hipótese, foi desenvolvido um sistema experimental no quais zigotos que foram analisados por fluorescência recuperação após o clareamento foto pode desenvolver a termo sem qualquer dano significativo. Importante, este sistema experimental precisa de apenas um aquecedor térmico-placa além de um laser confocal microscópio. As conclusões deste estudo sugerem que recuperação de fluorescência após análise de análise (FRAP) foto-branqueamento pode ser usado para investigar se os eventos moleculares na cromatina zigóticos são importantes para o desenvolvimento do termo.

Introduction

Após a fertilização, a estrutura da cromatina é alterada dinamicamente, e estrutura da cromatina zigóticos é então eventualmente estabelecido1,2. Durante este período, em pró-núcleos paternos, proteínas da cromatina dominante é mudada de protamina na histona. A cromatina resultante é extremamente diferente dos espermatozoides e ovócitos femininos em vários pontos (por exemplo, composição variante de histona, modificação de histona). Assim, a cromatina foi formada é pensada para ser importante para o posterior desenvolvimento embrionário. No entanto, apesar dos esforços para revelar os detalhes da estrutura da cromatina zigóticos durante longos períodos, métodos para avaliar a qualidade de zigotos ou para prever seu desenvolvimento termo na fase de uma célula, analisando sua estrutura da cromatina nunca foram estabelecido.

No estudo anterior, é descoberto que zigotos tem uma estrutura extremamente afrouxada cromatina3. Atualmente, frouxidão de cromatina ou abertura é acreditada para ser um importante factor de diferenciação celular potencial de células estaminais embrionárias (ES)4. Pilhas do ES não apresentam homogeneidade na natureza, mas são bastante heterogêneas; em colônias de células ES, alguns transitoriamente adquirem um maior potencial de diferenciação comparável aos blastômeros de embriões do estágio de duas células. Durante esta transição para a dois-célula como estado, frouxidão de cromatina no ES células no que é comparável com o estágio de duas células de embriões5alterações. Assim, frouxidão de cromatina parece ser importante para o potencial de diferenciação celular e é possível que abrir extensivamente cromatina em zigotos é útil para a avaliação do potencial de desenvolvimento zigóticos.

Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa que permite a análise dos eventos moleculares durante a ontogênese desde que esse método permite o posterior desenvolvimento e até mesmo termo desenvolvimento6. Como um dos métodos de imagem ao vivo, FRAP análise tem sido usado para examinar a frouxidão de cromatina embriões pré-implantação e ES células3,4,5. Se frouxidão zigóticos cromatina pode ser analisado sem um efeito prejudicial sobre o termo desenvolvimento pela análise FRAP, pode ser uma ferramenta valiosa para a avaliação da qualidade dos embriões na fase de uma célula. No entanto, os efeitos sobre o desenvolvimento do termo por esse método experimental não foram examinados. Recentemente, um sistema experimental usando FRAP avaliar frouxidão zigóticos cromatina foi desenvolvido. Porque este era um novo sistema de observação de zigotos, ele foi denominado como zigóticos FRAP (zFRAP). zFRAP não afetou criticamente termo desenvolvimento e tem sido relatado em outro lugar7. Neste relatório, é descrito o protocolo desse método experimental.

Protocol

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade de Yamanashi. O protocolo foi aprovado pelo Comité sobre a ética de experimentos Animal da Universidade de Yamanashi (número de licença: A24-50). Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia tribromoetanol, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Uma visão geral ilustrada dos procedimentos e horário são mostrados na Figur…

Representative Results

análise de zFRAP com eGFP-H2B Devidamente produzida mRNA codificação eGFP-H2B, que é visto como uma banda deslocou causada por poli um rejeito (Figura 2A), foi injetado no citoplasma de zigotos com um corpo polar 2 em 1-3 h após a inseminação (Figura 2B). 8 a 12 h após a inseminação, zigotos com 2 pró-núcleos mostrando a expressão de eGFP-H2B foram coletadas e…

Discussion

Como revelado neste estudo, a análise zFRAP não causa danos críticos para o desenvolvimento do termo, sugerindo que este método é uma ferramenta muito útil para revelar a associação entre eventos moleculares e o potencial do desenvolvimento embrionário. Durante a reprogramação, para as duas câmaras como estado de pilhas do ES, pelo qual o potencial diferencial dessas células torna-se tão elevado como aquele do estágio de duas células, frouxidão de cromatina de mudanças em que comparável com embriões d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura e Kana Kishida fornecendo comentários críticos e suporte técnico. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo programa do Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia para promover a reforma das universidades nacionais, m.o.; a sociedade japonesa para a promoção da ciência (16H 02593), Asada Science Foundation e da Fundação de ciência Takeda para TW Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Materials

Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

References

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Cite This Article
Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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