Summary

Zygotic Fluoreszenz Erholung nach dem Foto-bleichen-Analyse für Chromatin Lockerheit, die volle Laufzeit Entwicklung ermöglicht

Published: June 12, 2018
doi:

Summary

Chromatin Lockerheit scheint das Entwicklungspotenzial der Blastomeren beteiligt zu sein. Es ist jedoch nicht bekannt, ob Chromatin Lockerheit als ein zuverlässiger Index für das Entwicklungspotenzial für Embryonen verwendet werden kann. Hier wurde ein experimentelles System in dem Chromatin Lockerheit bewertet Zygoten, volle Amtszeit entwickeln können beschrieben.

Abstract

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die Analyse der molekularen Ereignisse während der Ontogenese. Vor kurzem hat Chromatin Lockerheit oder Offenheit gezeigt an das zelluläre Differenzierung Potenzial der pluripotenten embryonalen Stammzellen zu beteiligen. Es wurde bereits berichtet, dass im Vergleich mit embryonalen Stammzellen Zygoten beherbergen eine extrem gelockert Chromatinstruktur, was auf seine Verbindung mit ihren Totipotenz. Allerdings ist bis jetzt nicht angesprochen worden ob diese extrem gelockert/offene Chromatinstruktur für embryonale Entwicklungspotenzial wichtig ist. In der vorliegenden Studie wurde entwickelt, um diese Hypothese zu prüfen ein experimentelles System in die, das Zygoten, die durch Fluoreszenz analysiert wurden Erholung nach dem Foto bleichen Begriff ohne erhebliche Schäden entwickeln kann. Wichtig ist, braucht dieses experimentelle System nur eine Thermoskanne-Platte Heizung neben einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop. Die Ergebnisse dieser Studie deuten, Fluoreszenz-Erholung nach Foto-bleichen-Analyse (FRAP)-Analyse verwendet werden kann, zu untersuchen, ob die molekularen Ereignisse im zygotic Chromatin für voll ausgetragenen Entwicklung wichtig sind.

Introduction

Nach der Befruchtung die Chromatinstruktur ist dynamisch verändert und zygotic Chromatinstruktur ist dann schließlich etablierte1,2. Während dieser Zeit, im väterlichen Vorkerne wird die dominante Chromatin-Proteins von Protamin in Histon geändert. Die daraus resultierende Chromatin ist sehr verschieden von der Spermien und weibliche Eizellen in mehreren Punkten (z.B., Histon Variante Komposition, Histon-Modifikation). So wird gebildeten zygotic Chromatin gedacht, um für spätere embryonale Entwicklung wichtig sein. Jedoch trotz der Bemühungen um die Einzelheiten der zygotic Chromatinstruktur über einen längeren Zeitraum zu offenbaren, noch Methoden zur Bewertung der Qualität von Zygoten oder ihre volle Laufzeit Entwicklung im 1-Zell-Stadium vorherzusagen, durch die Analyse ihrer Chromatinstruktur war nie gegründet.

In der vorangegangenen Studie ist es entdeckt, dass Zygoten eine extrem gelockert Chromatin Struktur3. Derzeit ist Chromatin Lockerheit oder Offenheit vermutlich ein wichtiger Faktor für die zelluläre Differenzierung Potenzial embryonaler Stammzellen (ES) Zellen4. ES-Zellen weisen nicht auf Homogenität in der Natur, sondern sind eher heterogen; in ES Zelle Kolonien erwerben einige vorübergehend ein höhere Differenzierung Potenzial Blastomeren zwei-Zell-Stadium Embryos vergleichbar. Während dieses Übergangs in die zwei-Zelle wie Staat Zellen Chromatin Lockerheit in ES verwandelt sich in was mit zwei-Zell-Stadium Embryonen5vergleichbar ist. So scheint Chromatin Lockerheit wichtig sein für zelluläre Differenzierung Potenzial und es ist möglich, die ausgiebig Chromatin in Zygoten öffnen ist nützlich für die Bewertung der zygotic Entwicklungspotenzial.

Live Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das ermöglicht die Analyse der molekularen Ereignisse während der Ontogenese, da diese Methode ermöglicht eine spätere Entwicklung und sogar voll ausgetragenen Entwicklung6. Als einer der live bildgebenden Verfahren wurde FRAP Analyse zur Chromatin Lockerheit in preimplantation Embryos und ES Zellen3,4,5zu prüfen. Wenn zygotic Chromatin Lockerheit durch FRAP Analyse ohne eine nachteilige Wirkung auf voll ausgetragenen Entwicklung analysiert werden kann, kann es sein, ein wertvolles Instrument für die Bewertung der Qualität der Embryonen im 1-Zell-Stadium. Allerdings sind die Auswirkungen auf die volle Laufzeit Entwicklung von dieser experimentellen Methode nicht untersucht worden. Vor kurzem wurde ein experimentelles System mit FRAP auszuwertende zygotic Chromatin Lockerheit entwickelt. Da dies ein neues Beobachtungssystem für Zygoten war, wurde es als zygotic FRAP (zFRAP) bezeichnet. zFRAP nicht voll ausgetragenen Entwicklung kritisch auf und wurde an anderer Stelle7gemeldet. In diesem Bericht wird das Protokoll dieser experimentellen Methode beschrieben.

Protocol

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der Universität Yamanashi durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen von der Universität Yamanashi genehmigt (Anzahl erlauben: A24-50). Alle Operationen wurden unter Tribromoethanol Anästhesie durchgeführt, und alle Anstrengungen wurden unternommen, um Leiden zu minimieren. Eine bebilderte Übersicht der Verfahren und der Zeitplan sind in <strong c…

Representative Results

zFRAP Analyse mit eGFP-H2B Richtig produziert wurde mRNA Kodierung eGFP-H2B, das gesehen wird, da eine verschobene Band durch Poly eine Tailing (Abbildung 2A) verursacht, in das Zytoplasma der Zygoten mit einer 2. Polkörper 1-3 h nach der Insemination (Abb. 2 b) injiziert. 8 bis 12 h nach der Besamung, Zygoten mit 2 Vorkerne zeigt den Ausdruck der eGFP-H2B wurden gesammel…

Discussion

Wie in dieser Studie offenbart, verursacht die zFRAP Analyse keine kritischen Schaden voll ausgetragenen Entwicklung, was darauf hindeutet, dass diese Methode ist ein sehr nützliches Tool um die Zuordnung zwischen molekularen Ereignisse und das embryonale Entwicklungspotenzial zu offenbaren. Während der Reprogrammierung, in der zwei Zellen wie Staat der ES-Zellen, die wodurch die differenzielle Potenzial dieser Zellen so hoch wie die der zwei-Zell-Stadium Embryos wird wandelt Chromatin Lockerheit, die vergleichbar mit …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura und Kana Kishida für die kritischen Anmerkungen und technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise finanziert durch das Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie Programm zur Förderung der Reform der Universitäten des Landes, M.O.; der Japan Society for the Promotion of Science (16H 02593), Asada Science Foundation und der Takeda Science Foundation, t.w. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

Materials

Confocal laser scaning microscope Olympus FV1200 FV1000 can be also used for FRAP analysis (reference #7)
Thermo plate Tokai Hit TP-110RH26
Inverted microscope Olympus IX71
Micro manupilator Narishige MMO-202ND
Pieze Micro Micromanipulator Prime tech PMAS-CT150
35 mm culture dish Falcom 351008 35 x 100 mm style; for IVF
60 mm culture dish Falcom 351007 60 x 15 mm style; for embryo culture
50 mm culture dish Falcom 351006 50 x 9 mm style; for manipulation on the stage
50 mm glass bottom dish Matsunami D910400 50 mm dish, 27 mm φ hole size; for FRAP analysis
Mineral oil Organic spceiality chemicals 625071 For FRAP analysis on the glass bottom dishes
Mineral oil Sigma M8410-1L For IVF and embryo culture
glass capillary Drummond 1-000-1000 For handling mouse zygotes
Borosilicate glass Prime tech B100-75-10-PT For microinjection of mRNA
Micropipett puller Sutter instrument P-97/IVF For preparation of the injection or holding neadle (out side diameter: 80 µm, inner diameter: 10 µm) 
Microforge  Narishige MF-900
mMESSAGE MACHINE SP6 Transcription kit Thermo
Fisher scientific
AM1340
Poly (A) tailing kit Thermo
Fisher scientific
AM1350
PVP solution 10% (PVP-HTF) IrvineSceientific 99311 HEPES buffered HTF containing 10% PVP
Sodium HEPES Sigma H3784
pTOPO eGFP-H2B Template plasmid for eGFP-H2B mRNA (reference #6)
NorthernMax Gly Sample loading Dye  Thermo
Fisher scientific
AM8551 For electrophoresis of in vitro transcribed mRNA
Phenol chloroform isamyl alcohol nacalai tesque 25970-14
Chloroform nacalai tesque  08401-65
Not I TOYOBO NOT-111X
Ethachinmate WAKO 318-01793
3664 Otical power meter Hioki 3664  Power meter for laser power
Stereomicmicroscope Olympus SZX16

References

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Cite This Article
Ooga, M., Funaya, S., Aoki, F., Wakayama, T. Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development. J. Vis. Exp. (136), e57068, doi:10.3791/57068 (2018).

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