Investigação da síntese do RNA usando 5-Bromouridine rotulagem e imunoprecipitação
Summary
Esse método pode ser usado para medir a síntese do RNA. 5-Bromouridine é adicionado às células e incorporado na RNA sintetizado. Síntese de RNA é medido pela extração do RNA imediatamente depois da rotulagem, seguido de 5-Bromouridine-alvo da imunoprecipitação de rotulados RNA e análise por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa.
Abstract
Quando os níveis de estado estacionário do RNA são comparados entre duas condições, não é possível distinguir se as alterações são causadas por alterações na produção ou degradação do RNA. Este protocolo descreve um método para a medição da produção de RNA, usando 5-Bromouridine de rotulagem do RNA seguido por imunoprecipitação, que permite a investigação do RNA sintetizado dentro de um curto espaço de tempo (por exemplo, 1 h). A vantagem de 5-Bromouridine-rotulagem e imunoprecipitação sobre o uso de inibidores de transcriptional tóxicos, tais como α-amanitin e actinomicina D, é que não há nenhum ou muito baixos efeitos na viabilidade celular durante o uso a curto prazo. No entanto, porque 5-Bromouridine-imunoprecipitação captura apenas RNA produzido dentro do tempo curto de rotulagem, lentamente produzido, bem como rapidamente degradada RNA pode ser difícil de avaliar por esse método. O RNA 5-Bromouridine-rotulados capturado por imunoprecipitação-5-Bromouridine pode ser analisado por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase quantitativa na próxima geração de sequenciamento. Todos os tipos de RNA podem ser investigados, e o método não está limitado a medição do mRNA, tal como é apresentado neste exemplo.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) imunoprecipitação (IP) permite o estudo da produção de RNA em células com n ou efeitos muito limitados na fisiologia de células durante o breve período1,2de rotulagem. O método baseia-se a incorporação do derivado sintético uridina BrU em RNA recém sintetizado seguido pelo IP do RNA rotulado usando anticorpos anti-BrU (Figura 1).
Tem sido conhecido por décadas a síntese de proteínas pode ser transcriptionally regulado, e a existência de factores de transcrição foi hipotetisada há mais de 50 anos3. Hoje, é conhecido que várias doenças são causadas pela desregulação de transcrição e a estabilidade do RNA (S1 Figura complementar em referência4), e a capacidade de medir as mudanças na produção do RNA é de grande importância na doença de compreensão desenvolvimento.
Por outro lado, ferramentas para regular a produção de RNA fornecem novas possibilidades para o tratamento de doenças causadas pela expressão de proteína muito pouco ou demais, ou acúmulo de proteína, como na doença de Parkinson (PD). A proteína predominante acumulando agregados como insolúveis em PD é α-synuclein, e o nível de α-synuclein está diretamente ligado à doença, como a multiplicação de gene do gene da α-synuclein causa familiar PD5. Além disso, α-synuclein agrega de forma dependente de concentração. Downregulation dos níveis de mRNA de α-synuclein, portanto, é uma estratégia terapêutica interessante, que tem sido conseguida com êxito usando a interferência do RNA para diminuir a perda de célula neuronal em modelos de roedores de PD6,7.
É importante ser capaz de medir as mudanças na produção de RNA causada por doença ou intervenções terapêuticas. Métodos de última geração para medição níveis de estado estacionário de RNA, como a transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), não são capazes de distinguir entre alterações causadas por regulamento transcriptional ou alterados Estabilidade do RNA. Um método amplamente utilizado para a investigação de taxas de decaimento de RNA está bloqueando da maquinaria transcricional usando compostos tais como α-amanitin ou actinomicina D, seguido por medições de RNAs os decadentes. No entanto, existem alguns problemas associados com um bloqueio geral da transcrição em células, como a indução de apoptose8,9. Ao lado dos efeitos citotóxicos, inibidores transcriptional também apresentam vários problemas técnicos, como a lenta absorção celular de α-amanitin e falta de especificidade de actinomicina D (revisto em referência10).
Para evitar o bloqueio total da transcrição, têm sido utilizados análogos de nucleotídeos, tais como uridina 5-ethynyl (5-UE), 4-thiouridine (TU-4) e BrU. Estes são prontamente ocupados por células de mamíferos e incorporadas RNA recém sintetizado, permitindo pulso-rotulagem do RNA dentro de um intervalo de tempo específico. BrU é menos tóxico do que o 5-UE e 4-TU, tornando-se o preferido análogo escolha11,12.
BrU-IP pode ser usado para investigar tanto a taxa de síntese de RNA e estabilidade e, portanto, distinguir entre as causas de alterações no RNA total. Este artigo incidirá sobre a medição de síntese de RNA e refere-se a referência2 para obter detalhes sobre a investigação da estabilidade do RNA. Para investigar a síntese do RNA, as células são brevemente rotuladas com BrU , por exemplo, para 1 h, seguido por BrU-IP1 (Figura 1). Isso permite que as medições do RNA sintetizado no curto prazo rotulagem e mudanças observadas dará uma melhor estimativa de regulamentos na síntese de RNA do que através da medição de alterações no RNA total por RT-qPCR. Deve ser mencionado, no entanto, que, apesar do tempo de rotulagem, por exemplo, apenas 1 h, degradação ainda pode ter uma influência sobre os níveis de RNA observada.
RNA de experimentos de BrU-IP são adequados para análise a jusante por tanto RT-qPCR1 ou próxima geração sequenciamento2,13. Outros métodos de detecção de RNA padrão, tais como a mancha do Norte ou ensaio da proteção ribonuclease, podem também ser aplicáveis para certos RNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve o uso de BrU-IP para determinação da produção de RNA pela rotulagem dos recém produzido RNA 1 h com BrU, seguido pela extração de RNA imediata e imunoprecipitação de RNA com rótulo BrU. Este método tem sido descrito anteriormente na referência16, e este artigo inclui algumas etapas adicionais para aumentar a especificidade do IP e pureza de RNA, por grânulos de pré-tratamento com baixas concentrações de BrU, bem como uma etapa de purificação de fenol-cloro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Fundação Lundbeck, Universidade de Aarhus, Dandrite e Lundbeck a/s com suporte a este trabalho.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
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