Исследования синтеза РНК с помощью 5-Bromouridine маркировки и иммунопреципитации
Summary
Этот метод может использоваться для измерения синтез РНК. 5-Bromouridine добавляется к клеткам и включены в синтезированных РНК. Синтез РНК измеряется РНК добыча сразу после маркировки, следуют 5-Bromouridine ориентированные иммунопреципитации помечены РНК и анализ обратной транскрипции и количественных полимеразной цепной реакции.
Abstract
При установившемся РНК уровни сравнении между двумя условиями, невозможно отличить ли изменений вызванных изменений в производство или деградации РНК. Этот протокол описывает метод для измерения производства РНК, используя 5-Bromouridine маркировки РНК, следуют иммунопреципитация, который позволяет расследования РНК синтезируется в течение короткого периода времени (например, ч. 1). 5-Bromouridine маркировка и иммунопреципитации преимущество использования токсичных transcriptional ингибиторы, такие как α-аманитин и дактиномицин D, что есть нет или очень низкое воздействие на жизнеспособность клеток во время кратковременного использования. Однако потому что только 5-Bromouridine иммунопреципитация захватывает РНК в течение короткого времени маркировки, медленно производства, а также быстро деградируют РНК может быть трудно измерить этим методом. 5-Bromouridine помечены РНК, захвачен 5-Bromouridine иммунопреципитация могут быть проанализированы по обратной транскрипции, количественные полимеразной цепной реакции и следующего поколения последовательности. Все типы РНК могут быть исследованы, и этот метод не ограничивается измерения mRNA, как представлено в этом примере.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) иммунопреципитации (IP) позволяет исследование производства РНК в клетках с нет или очень ограниченное воздействие на клетки физиологии во время краткого маркировки периода1,2. Метод основан на включения синтетических уридина производной Бру в недавно синтезированных РНК после IP помечены РНК, с использованием антител анти Бру (рис. 1).
Он был известен за десятилетия этот синтез белка может регулироваться транскрипционно, и существование транскрипционных факторов было предположить более чем 50 лет назад3. Сегодня, как известно, что некоторые заболевания вызваны регуляции транскрипции и стабильности РНК (дополнительная цифра S1 в ссылка4), и способность измерять изменения в производстве РНК имеет большое значение в понимании болезни развития.
С другой стороны инструменты для регулирования производства РНК обеспечивают новые возможности для лечения заболеваний, вызванных слишком мало или слишком много белков, или накопление белка как при болезни Паркинсона (PD). Преобладающим белок, накапливается в нерастворимые агрегатов в PD-α-synuclein, и уровень α-synuclein непосредственно связан с этой болезни, как ген умножение гена α-synuclein вызывает семейная PD5. Кроме того α-synuclein агрегатов в концентрации зависимым образом. Даунрегуляция уровни mRNA α-synuclein поэтому является интересным терапевтические стратегии, которая успешно достигнут с помощью РНК-интерференции для уменьшения потери нейрональных клеток в PD грызунов модели6,7.
Важно иметь возможность измерить изменения в производстве РНК, вызванной болезнью или терапевтических вмешательств. Современные методы для измерения уровней устойчивого состояния РНК, например обратной транскрипции, следуют количественных полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР), не способны различать между изменений, вызванных регуляцию или изменены РНК стабильности. Широко используемый метод для исследования РНК распада ставок блокируется транскрипционный анализ механизма, с помощью соединений, таких как α-аманитин или актиномицин Д следуют измерений распадаясь РНК. Однако существуют некоторые проблемы, связанные с общей блокировки транскрипции в клетках, таких как индукции апоптоза8,9. Рядом с цитотоксическими эффектами транскрипционный анализ ингибиторы также присутствует ряд технических вопросов, таких как медленно клеточного поглощения α-аманитин и неконкретный характер актиномицин Д (обзор в ссылка10).
Чтобы избежать общей блокировки транскрипции, были использованы нуклеотида аналогов, например уридина 5-ethynyl (5-ЕС), 4-thiouridine (4-ту) и Брю. Эти легко принятые mammalian клеток и включены в недавно синтезированных РНК, позволяя пульс маркировки РНК в конкретные сроки. Брю менее токсичен, чем 5-ЕС и 4-ту, что делает его предпочтительным аналог выбор11,12.
Бру-IP может использоваться для расследования скорость синтеза РНК и стабильности и таким образом отличать причины изменения в целом РНК. Эта статья будет сосредоточена на измерении синтез РНК и относится к ссылки2 подробную информацию о расследовании РНК стабильности. Расследовать синтез РНК, клетки обозначены кратко с BrU например за 1 ч, следуют IP Бру-1 (рис. 1 c). Это позволяет измерения РНК синтезируется в течение короткого времени маркировки и наблюдаемые изменения даст более точную оценку положения в синтез РНК, чем путем измерения изменений в целом РНК по RT-ПЦР. Следует отметить, однако, что хотя время маркировки, например, только 1 h, деградация все еще может иметь влияние на РНК уровней, наблюдаемых.
RNA от BrU-IP экспериментов подходят для вниз по течению анализа RT-ПЦР1 или2,последовательность следующего поколения13. Другие стандартные методы обнаружения РНК, например Северный blotting или анализа защиты рибонуклеаза, могут также применяться для некоторых РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает использование BrU-IP для определения РНК производства, маркировки вновь производится РНК за 1 час с Бру, затем немедленное извлечение RNA и иммунопреципитации BrU помечены РНК. Этот метод был описан ранее в ссылка16, и эта статья включает в себя некоторые д…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Фонд компании «Лундбек», Орхусе университет, Dandrite и Lundbeck антиспама поддерживает эту работу.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?. Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. . Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2′-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
