Summary

Laminaire stroming gebaseerde testen te onderzoeken Leukocyte aanwerving op gekweekte vasculaire cellen en aanhangend bloedplaatjes

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

Leukocyten interactie gretig met vasculaire cellen en trombocyten na vaartuig muur letsel of tijdens ontsteking. Hier beschrijven we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde assay karakteriseren de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners.

Abstract

De aanwerving van de leukocyten op letsel of ontsteking naar sites van letsel of weefselbeschadiging van het is onderzocht tijdens de afgelopen decennia en heeft geleid tot het concept van de leukocyten hechting cascade. Echter, de exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten hebben niet nog volledig geïdentificeerd. Aangezien leukocyte werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en immuun onderzoek (auto-), presenteren we een eenvoudig laminaire flow gebaseerde bepaling aan de studie van de onderliggende mechanismen van de hechting, ambtshalve adhesie, en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. De in vitro -assay kan worden gebruikt voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de interacties tussen leukocyten en hun cellulaire partners in verschillende modellen van vasculaire ontsteking. Dit protocol beschrijft een laminaire flow gebaseerde bepaling met behulp van een parallel-flow kamer en een omgekeerde fasecontrastmicroscoop aangesloten op een camera te bestuderen van de interacties van leukocyten en endotheliale cellen of Trombocyten, die kunnen worden gevisualiseerd en vervolgens geregistreerd off line geanalyseerd. Endotheliale cellen, bloedplaatjes of leukocyten kunnen worden voorbehandeld met remmers of antilichamen te bepalen van de rol van specifieke moleculen tijdens dit proces. Schuintrekken voorwaarden, d.w.z. arteriële of veneuze schuifspanning, kunnen gemakkelijk worden aangepast door de viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal.

Introduction

Op verwonding, ontsteking of infectie beantwoorden leukocyten snel aan pathogen – of schade-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs, DAMPs) omzetten in een geactiveerde staat, en verlaat de bloedstroom naar sites van ontsteking en weefsel schade. Het vermogen van leukocyten om te interageren met hun omgeving cellulaire en moleculaire is essentieel voor de juiste functie als immune cellen, zoals benadrukt door genetische afwijkingen zoals leukocyte hechting deficiëntie1. Leukocyten hechting is het onderwerp van intensief onderzoek de afgelopen decennia geweest en dit heeft geresulteerd in het concept van de leukocyten hechting cascade in de vroege jaren 19902,3. Leukocyten hechting wordt geïnitieerd door de selectine-gemedieerde vangst van leukocyten aan het endotheel, waardoor de cellen om te rollen over de vasculaire oppervlak. Deze rollen kan leukocyten te scannen voor endotheel-afhankelijke trekkende signalen, bijvoorbeeld, chemokines, die de activering van de integrins induceren. Vervolgens bemiddelen de geactiveerde verschijnsel de binding aan endothelial liganden, wat resulteert in krachtige leukocyte arrestatie. Leukocyten kunnen vervolgens bereiden op extravasate door kruipen en verspreiden, voordat het endotheel enkelgelaagde doordringen en transmigrating in het onderliggende weefsel. Het basisconcept van de canonieke leukocyte cascade heeft grotendeels onveranderd gebleven sinds de invoering ervan, met enkele tussenstappen toegevoegd4. Niettemin, de exacte moleculaire mechanismen en de rol van de vele spelers die betrokken zijn bij de aanwervingsprocedures van de leukocyten nog niet zijn opgehelderd tot nu toe, en leukocyten werving blijft een belangrijk onderwerp op het gebied van infectie, ontsteking en (auto-) immuun onderzoek.

Bijvoorbeeld verhoogd tijdens vasculaire ontstekingsziekten zoals atherosclerose, leukocyte inlijving in het vaartuig muur stations plaque ontwikkeling. Unstable atherosclerotische plaques kunnen scheuren, leidt tot massale activering van bloedplaatjes en het systeem van de coagulatie, en vervolgens tot occlusie van het vaartuig5. Dit kan resulteren in ernstige cardiovasculaire uitkomsten zoals een hartinfarct of beroerte. Daarnaast endothelial denudatie als het optreedt klinisch, bijvoorbeeld na stenting van een kransslagader, leidt tot een veelheid van interacties van leukocyten en trombocyten naar de blootgestelde vaartuig muur binnenland (b.v., matrix onderdelen en glad spier cellen) en leukocyten met bloedplaatjes die betrekking hebben op de vasculaire verwonding. Deze interacties zijn belangrijk voor de verdere ontwikkeling van de ziekte zoals monocyt-bloedplaatjes interacties6,7van de vorming van de neointima zou rijden. Bovendien, bloedplaatjes-leukocyte interacties gemedieerd door leukocyten integrine Mac-1 (αMβ2) en bloedplaatjes GPIbα hebben onlangs geïdentificeerd als roman bestuurders van trombose in muizen8.

Gezien de brede beschikbaarheid van mens en dier bloed als een bron van leukocyten en trombocyten voor onderzoek en het brede spectrum van moleculen van geïsoleerde matrix en vereeuwigd cellijnen van leukocyten en vasculaire oorsprong, is het mogelijk te simuleren van leukocyten interacties onder stroom in een laboratorium instellen, met behulp van speciaal ontworpen stroom perfusie kamers. Vele varianten hebben ontwikkeld in de afgelopen decennia, variërend van vacuüm-gedreven aan zelfklevende perfusie kamers. Alle varianten hebben gemeen dat het onbeweeglijke gedeelte (bijvoorbeeld, gekweekte vasculaire cellen of matrix eiwitten) is geassembleerd tot een grotere lekvrije kamer uitgerust met een vooraf gedefinieerde kanaal perfusie van vloeistoffen inschakelen via het onbeweeglijke gedeelte. Vooruitgang in technologie molding ingeschakeld bovendien de ontwikkeling van op maat gemaakte oplossingen op basis van silica polymeren9. De viscositeit en de stroomsnelheid van de perfused vloeistoffen en de hoogte van het kanaal voornamelijk de schuifspanning kenmerken van de stroom perfusie apparaat10te bepalen. In dit artikel presenteren we een studie van de onderliggende mechanismen van de hechting-, ambtshalve hechting is de methode van in vitro en transmigratie van leukocyten onder veneuze en arteriële stroom regimes. Het voordeel van de methoden die hier gepresenteerd is dat ze kunnen worden uitgevoerd met behulp van een gemeenschappelijk camera-aangesloten fluorescentie Microscoop, en geen een onderzoekers vereisen te hoge technische bekwaamheid bezitten. De in vitro -assay kan worden gemanipuleerd in vele opzichten (bijvoorbeelddoor het toevoegen van remmers of blokkeren van antilichamen), en is dus die van toepassing zijn in verschillende modellen van vasculaire ontsteking en laat het onderzoek wrijvingscoëfficiënt eiwitfuncties of de evaluatie van specifieke verbindingen.

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de medisch-ethische en dier ethische Boards van Universiteit Maastricht. 1. op stroming gebaseerde Assay met menselijke cellen Isolatie van bloedplaatjes uit menselijk bloed Citraat (3,2%) antistollingsmiddel veneuze bloed trekken. Voeg 1/15 hoeveelheid zuur citraat Dextrose toe (ACD: 80 mM Trinatriumcitraat citraat en citroenzuur 52 mM 183 mM glucose) naar het bloed. Cent…

Representative Results

Studeren endotheel-leukocyte hechting, werden fluorescently geëtiketteerde THP-1 cellen over een TNFα – of niet-gestimuleerd endothelial enkelgelaagde gedurende 2 minuten op 3 dyne/cm2geperfundeerd. Het totale aantal aanhangend monocytic cellen werd vastgesteld na 2 min van perfusie door het vastleggen van 6 onafhankelijke velden over een periode van 2-6 min. De Adherente cellen werden gekwantificeerd in ten minste 6 foto’s gevangen met een omgekeerde fase contrast/fluorescen…

Discussion

Deze in vitro -test is een eenvoudige methode om te onderzoeken van de onderliggende mechanismen van leukocyten aanwerving tijdens vasculaire ontsteking, maar er zijn een aantal kritische punten te worden opgemerkt. De eerste voorwaarde voor het succesvol uitvoeren van deze test is de perfusie van leukocyten over een intact en confluente vasculaire of bloedplaatjes enkelgelaagde. Dit kan worden bereikt door voorafgaande coating van de oppervlakken met collageen type I. In het algemeen, bij het werken met primair…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Drs. Martin M. Schmitt en lijn-Fraemohs. Dit werk werd gesteund door de Nederlandse Stichting voor wetenschappelijkonderzoek (ZonMW VIDI 016.126.358 Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR Nr. 1638) en het Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB1123/A2) toegekend aan R.R.K.

Materials

Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

References

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Play Video

Cite This Article
Vajen, T., Heinzmann, A. C., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

View Video