Summary

القائم على التدفق الصفحي فحوصات للتحقيق في تجنيد الكريات البيض على خلايا الأوعية الدموية مثقف والصفائح الدموية ملتصقة

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

الكريات البيضاء شوق تتفاعل مع خلايا الأوعية الدموية والصفائح الدموية بعد إصابة الجدار السفينة أو أثناء التهاب. وهنا يصف لنا تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لتوصيف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية.

Abstract

تجنيد الكريات البيضاء عند الإصابة أو التهاب للمواقع من ضرر أو تلف الأنسجة حققت خلال العقود الأخيرة، وقد أدى مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض لا بعد تماما حددت. التوظيف الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال العدوى والتهاب (السيارات) محصنة والبحوث، فإننا نعرض تحليل القائم على التدفق الصفحي مباشرة لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، و التهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. يمكن استخدام التحليل في المختبر لدراسة الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التفاعلات بين الكريات البيضاء وشركائها الخلوية في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية. ويصف هذا البروتوكول تحليل القائم على التدفق الصفحي استخدام دائرة التوازي-تدفق و مقلوب مجهر تباين المرحلة متصلة بكاميرا لدراسة التفاعلات بين الكريات البيضاء وخلايا بطانية أو الصفائح الدموية، التي يمكن أن تصور وتسجل ثم تحليل دون اتصال. يمكن pretreated خلايا بطانية أو الصفائح الدموية أو الكريات البيضاء مع مثبطات أو الأجسام المضادة لتحديد دور جزيئات محددة أثناء هذه العملية. شروط القص، أي الشرياني أو الوريدي القص الإجهاد، يمكن تكييفها بسهولة من اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة.

Introduction

عند الإصابة أو الالتهاب أو العدوى، الكريات البيضاء بسرعة الاستجابة الممرض أو الأضرار-المرتبطة بالجزيئات أنماط (بامبس، دامبس)، تغيير في حالة نشطة، والانتقال من مجرى الدم إلى مواقع لتلف الأنسجة والتهاب. قدرة الكريات البيضاء على التفاعل مع بيئتها الخلوية والجزيئية ضروري لوظيفتها الصحيحة كالخلايا المناعية، كما أبرزت الاضطرابات الوراثية مثل نقص التصاق الكريات البيض1. التصاق الكريات البيض خضعت لتحقيقات مكثفة خلال العقود الماضية وأسفر ذلك عن مفهوم تتالي التصاق الكريات البيض في أوائل التسعينات2،3. التصاق الكريات البيض تبدأ بإلقاء القبض على سيليكتين بوساطة الكريات البيضاء إلى البطانة، مما تسبب في الخلايا للفة فوق سطح الأوعية الدموية. هذا المتداول تمكن الكريات البيضاء المسح الضوئي لربط البطانة المهاجرة العظة، مثلاً، المستقطبات، والحث على تفعيل إينتيجرينس. وفي وقت لاحق، التوسط integrins المنشط الربط إلى يغاندس بطانية، أسفرت عن اعتقال الكريات البيض وطيد. في وقت لاحق قد تعد الكريات البيضاء اكسترافاساتي بالزحف والانتشار، قبل اختراق أحادي الطبقة البطانية وترانسميجراتينج إلى الأنسجة الكامنة. المفهوم الأساسي لسلسلة الكريات البيض المتعارف عليه قد يتغير إلى حد كبير منذ إطلاقها، مع بعض الخطوات الوسيطة وأضاف4. ومع ذلك، الآليات الجزيئية الدقيقة وأدوار العديد من اللاعبين المتورطين في تجنيد الكريات البيض لم توضح حتى الآن، وتجنيد الكريات البيض لا يزال موضوعا هاما في مجال الإصابة بالتهاب و (السيارات-) محصنة ضد البحث.

على سبيل المثال، أثناء أمراض التهاب الأوعية الدموية مثل تصلب الشرايين، زيادة تجنيد الكريات البيض في وضع اللوحة محركات الأقراص الجدار السفينة. قد تمزق لويحات تصلب الشرايين غير مستقرة، مما يؤدي إلى تنشيط واسعة النطاق لنظام التخثر والصفائح الدموية، وفيما بعد انسداد السفينة5. قد ينتج هذا عن نتائج القلب والأوعية الدموية الشديدة مثل احتشاء عضلة القلب أو السكتة الدماغية. وباﻹضافة إلى ذلك، تعرية غشائي كما يحدث سريرياً، مثلاً بعد الدعامات للشريان التاجي، يؤدي إلى العديد من التفاعلات من الكريات البيضاء والصفائح الدموية إلى داخل الجدار سفينة مكشوفة (مثلاً، عناصر المصفوفة وسلس خلايا العضلات) والكريات البيضاء مع الصفائح الدموية تغطي إصابة الأوعية الدموية. هذه التفاعلات تعتبر هامة لمواصلة تطوير هذا المرض كما قد تدفع التفاعلات الوحيدات-الصفائح الدموية نيوينتيما تشكيل6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، توسط التفاعلات الكريات البيض الصفيحات الكريات البيض إنتغرين ماك-1 (α βم2) والصفائح الدموية GPIbα قد حددت مؤخرا كسائقين رواية تجلط الدم في الفئران8.

ونظرا لتوافر الدم البشري والحيواني على نطاق واسع كمصدر للكريات البيضاء والصفائح الدموية للبحوث، وطائفة واسعة من الجزيئات مصفوفة معزولة وخطوط الخلية مخلدة الكريات البيض ومنشأ الأوعية الدموية، أنه من الممكن لمحاكاة الكريات البيض التفاعلات تحت التدفق في مختبر للإعداد، باستخدام الدوائر نضح تدفق مصممة خصيصا. وقد صممت العديد من المتغيرات العقود الماضية، بدءاً من يحركها الفراغ إلى الدوائر نضح ذاتية اللصق. كافة المتغيرات تشترك في هذا الجزء غير متحركة (مثلاً، واستزراع خلايا الأوعية الدموية أو مصفوفة البروتينات) يتم تجميعها إلى غرفة مانعة للتسرب أكبر مزودة بقناة معرفة مسبقاً تمكين نضح السوائل فوق الجزء غير متحرك. وباﻹضافة إلى ذلك، مكن التقدم في صب التكنولوجيا وضع حلول مخصصة استناداً إلى السليكا البوليمرات9. اللزوجة ومعدل التدفق للسوائل perfused والارتفاع للقناة أساسا تحديد خصائص القص إجهاد الجهاز نضح تدفق10. في هذه المقالة، نقدم الأسلوب في المختبر لدراسة الآليات الكامنة للالتصاق، الالتصاق دي، والتهجير من الكريات البيضاء تحت أنظمة التدفق الوريدي والشرياني. استفادة الأساليب المقدمة هنا هو أنها يمكن أن يؤديها باستخدام مجهر الأسفار كاميرا متصلة مشتركة، ولا تتطلب من المجربون أن تمتلك الكفاءة التقنية العالية. الفحص في المختبر يمكن التلاعب بطرق عديدة (مثلاً، عن طريق إضافة مثبطات أو حجب الأجسام المضادة)، وهكذا قابلاً للتطبيق في نماذج مختلفة من التهاب الأوعية الدموية ويسمح التحقيق في التصاق وظائف البروتين أو تقييم لمركبات معينة.

Protocol

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها الأخلاقية الطبية ومجالس الأخلاقية الحيوان في جامعة ماستريخت. 1-تدفق على أساس مقايسة مع الخلايا البشرية عزل الصفائح الدموية من الدم البشري سحب الدم الوريدي في تخثر سترات (3.2 في المائة). إضافة إلى حجم 1/15 من “حمض سترات ?…

Representative Results

دراسة التصاق غشائي الكريات البيض، كانت perfused المسمى فلوريسسينتلي THP-1 خلايا أكثر TNFα-أو غير-حفز غشائي أحادي الطبقة لمدة 2 دقيقة في 3 داين/سم2. العدد الإجمالي للخلايا مونوسيتيك ملتصقة تحددها بعد 2 دقيقة من نضح التقاط 6 حقول مستقلة على مدى فترة من 2-6 دقيقة. تم قياس كمية الخل…

Discussion

هذا التحليل في المختبر وسيلة مباشرة للتحقيق في الآليات الأساسية للتوظيف الكريات البيض أثناء التهاب الأوعية الدموية، ولكن هناك بعض النقاط الحرجة للإشارة إلى. الشرط الأول لنجاح إجراء هذا الفحص هو نضح من الكريات البيضاء حالها والمتلاقية الأوعية الدموية أو أحادي الطبقة الصفائح الدموي?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور مارتن م. شميت وخط فرايموهس. هذا العمل كان تدعمه “مؤسسة هولندا” “البحث العلمي” (زونمو على 016.126.358 اندشتاينر مؤسسة بحوث نقل الدم (Nr. 1638) والألمانية الأوقيانوغرافية (SFB1123/A2) منحت إلى R.R.K.

Materials

Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL Life Technologies Europe bv
Pump e.g. model: 210-CE  world precision instruments 78-9210W
Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish corning 353001
50 mL syringe Becton Dickinson 300137
Silicone tubing  VWR 228-0700
Elbow Luer Connector Male Ibidi 10802
Female Luer Lock Coupler Ibidi 10823
Flow chamber University Hospital RWTH Aachen Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen. 2005. 
Ibidi sticky slide VI 0.4 Ibidi 80608
Coverslips for sticky slides  Ibidi 10812
Collagen Type I, rat tail Life Technologies Europe bv A1048301
Recombinant Human TNF-α Peprotech 300-01A
Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP – 6) Anaspec / Eurogentec 24191
SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain Life Technologies Europe bv S7575
Hanks’ Balanced Salt Solution 10x Sigma-Aldrich Chemie H4641
HEPES buffer solution 1M, liquid Life Technologies Europe bv 15630049
BUMINATE Albumin, 25%  Baxter 60010
Water for injection B. Braun 3624315
Calcium chloride dihydrate Merck 102382 
Magnesium chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich Chemie M2670
Apyrase Sigma-Aldrich Chemie A6535
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) Promocell GmbH C-12203
Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use) Promocell GmbH C-22010
Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC) ATCC  PCS-100-011
Vascular Cell Basal Medium  ATCC PCS-100-030
Endothelial Cell Growth Kit-BBE ATCC PCS-100-040
Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC) ATCC PCS-100-012
Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit ATCC PCS-100-042
Human endothelial cell line, EA.hy926 ATCC CRL-2922
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ATCC 30-2002
Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10) ATCC CRL-2181
Human Monocytic cell line, THP-1 DSMZ ACC-16
RPMI 1640 with Ultra-Glutamine Lonza BE12-702F/U1
Mouse monocyte/macrophage RAW264.7 ATCC TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose Gibco 11965092
Accutase Promocell GmbH C-41310
Percoll Sigma-Aldrich Chemie P1644
Histopaque 1119 Sigma-Aldrich Chemie 11191
10x PBS Life Technologies Europe bv 14200075
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin Becton Dickinson 367876
VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%  Greiner Bio 455322
HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water Sigma-Aldrich Chemie Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood

References

  1. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).
  2. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).
  3. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
  4. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
  5. Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. L., Lutgens, E. Inflammation and immune system interactions in atherosclerosis. Cellular and Molecular Life Sciences. 70 (20), 3847-3869 (2013).
  6. Wang, Y., Sakuma, M., et al. Leukocyte engagement of platelet glycoprotein Ibalpha via the integrin Mac-1 is critical for the biological response to vascular injury. Circulation. 112 (19), 2993-3000 (2005).
  7. Zhao, Z., Vajen, T., et al. Deletion of junctional adhesion molecule A from platelets increases early-stage neointima formation after wire injury in hyperlipidemic mice. Journal of cellular and molecular medicine. , (2017).
  8. Wang, Y., Gao, H., et al. Leukocyte integrin Mac-1 regulates thrombosis via interaction with platelet GPIbα. Nature communications. 8, 15559 (2017).
  9. Fujii, T. PDMS-based microfluidic devices for biomedical applications. Microelectronic Engineering. 61-62, 907-914 (2002).
  10. Son, Y. Determination of shear viscosity and shear rate from pressure drop and flow rate relationship in a rectangular channel. Polymer. 48 (2), 632-637 (2007).
  11. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them. Journal of visualized experiments : JoVE. (36), e1724 (2010).
  12. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).
  13. Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis. Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).

Play Video

Cite This Article
Vajen, T., Heinzmann, A. C., Dickhout, A., Zhao, Z., Nagy, M., Heemskerk, J. W., Koenen, R. R. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. J. Vis. Exp. (134), e57009, doi:10.3791/57009 (2018).

View Video