Summary

Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Published: December 14, 2017
doi:

Summary

Este protocolo describe el uso de un dispositivo microfluídico automatizado personalizable para visualizar la formación de biopelículas de Candida albicans en condiciones fisiológicas de host.

Abstract

Candida albicans es el hongo más común patógeno de seres humanos, causando aproximadamente el 15% de los casos de sepsis adquirida en el hospital. Un atributo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma biofilms, comunidades estructuradas de células a superficies bióticas y abióticas. Pueden formar biopelículas de C. albicans en los tejidos del anfitrión, como capas de mucosa y en dispositivos médicos, tales como catéteres, marcapasos, prótesis y prótesis mixtas. Biofilms plantean desafíos clínicos significativos ya que son altamente resistentes a las perturbaciones físicas y químicas y pueden actuar como reservorios a semilla habían diseminada infecciones. Varios ensayos en vitro se han utilizado para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans , como ensayos de placa de microtitulación, mediciones de peso seco, ensayos de viabilidad celular y la microscopia confocal de exploración láser. Todos estos ensayos son ensayos de punto final único, donde se evalúa la formación del biofilm en un punto de tiempo específico. Aquí, describimos un protocolo para estudiar la formación de biopelículas en tiempo real usando un dispositivo microfluídico automatizado bajo condiciones de flujo laminar. Este método permite la observación de la formación de biopelículas, el biofilm se convierte con el tiempo, usando condiciones personalizables que imitan a los del huésped, tales como los encontrados en catéteres vasculares. Este protocolo puede utilizarse para evaluar los defectos de biofilm de mutantes genéticos, así como los efectos inhibitorios de agentes antimicrobianos en el desarrollo de biofilm en tiempo real.

Introduction

Candida albicans es un comensal miembro de la microbiota humana, sin embargo, es también un patógeno oportunista, capaz de causar infecciones fúngicas superficiales y graves1,2. Un rasgo importante de la virulencia de C. albicans es su capacidad de forma resistente y biofilms resistentes a los fármacos, comunidades de células adhirieron a una superficie y encerrado en una matriz extracelular de material1,3. Biopelículas de C. albicans son altamente estructurados, que contiene varias capas de varios tipos de células (alrededor de florecimiento levadura forma células, ovales células pseudohyphal y células hyphal tubulares)4. Desarrollo de biopelículas de C. albicans se inicia con la adherencia de las células de levadura-forma redonda a una superficie (siembra el biofilm), seguida de la proliferación de estas células en la superficie, y luego de la maduración del biofilm inmaduro la estructura en un biofilm formado completamente rodeada por material de matriz extracelular4. El biofilm madurito se compone predominante de las células hyphal alargadas que forman redes densas y comunicadas, proporcionando la estabilidad arquitectónica al biofilm4. Durante todo el ciclo de vida del biofilm, levadura de florecimiento las células dispersan de la biopelícula madura y pueden viajar a otras regiones del cuerpo para causar infecciones diseminadas o semilla nuevos biofilms en otros sitios4,5. C. albicans puede formar biofilms en superficies bióticas, tales como superficies de la mucosa y tejido anfitrión y en superficies abióticas, como catéteres, marcapasos, prótesis y articulaciones protésicas. Debido a las propiedades recalcitrantes de biopelículas, que son extremadamente difíciles de erradicar y en muchos casos la estrategia del único tratamiento eficaz es retiro del dispositivo infectado4. Por lo tanto es crucial investigar formación de biopelículas en condiciones similares a los observados en contextos clínicos.

Hay varias críticas en vivo modelos animales usados para el estudio de C. albicans biofilm formación6,7,8; sin embargo, estos estudios pueden ser costoso, desperdiciador de tiempo y están limitados por el número de cepas y de agentes antimicrobianos que se pueden probar en un momento dado. In vitro biofilms ensayos, por el contrario, permiten la evaluación rápida, alto rendimiento de compuestos antifúngicos y de cepas mutantes y son mucho más rentables y ético que biofilm ensayos llevados hacia fuera en animales modelos9, 10,11,12,13,14. Aquí se describe un ensayo en vitro que hemos desarrollado y optimizado para observar la formación de biopelículas temporal bajo flujo laminar utilizando dispositivo microfluídico personalizable14,15. El ensayo permite la visualización de cada etapa de formación de biopelículas, como el paso de adherencia inicial, proliferación celular, maduración de la biopelícula y dispersión de células. El ensayo también es útil para visualizar cambios de morfología de la célula durante el desarrollo de un biofilm.

Las placas de microtitulación, que normalmente se utilizan para en vitro los ensayos de biofilm, mientras que de alto rendimiento, no se permiten para condiciones de flujo controlado. Flujo laminar tradicional célula sistemas permiten la evaluación continua de la formación de biofilm en condiciones de controlar el flujo, pero éstos a menudo son lentos y suelen tener limitados rendimiento y control de rango dinámico. El dispositivo de microfluidos utilizado aquí supera estas limitaciones mediante la combinación de placas de alto rendimiento (contiene 48 pozos) con una cámara de flujo laminar incorporado y es altamente reproducible, versátil y personalizable.

Aquí, describimos un protocolo para el uso de un dispositivo microfluídico automatizado disponible en el mercado para evaluar la formación de biopelículas de un tipo salvaje C. albicans cepa, los efectos de un agente antifúngico conocido en el desarrollo de un biofilm y biofilm defectos de formación en dos cepas mutantes (bcr1Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) que se reportaron anteriormente que biofilm in vitro e in vivo16,17,18. El protocolo descrito puede utilizarse para probar la eficacia de los agentes antimicrobianos en la inhibición de formación de biopelículas en el desarrollo de un biofilm y para identificar los genes requeridos para el desarrollo de biofilm normal por detección mutantes bibliotecas.

Protocol

1. fungicidas de la célula cultura preparación Nota: Cultivo de células de conducta trabajo (es decir, la abertura criogénicos stock tubos, tubos de cultivo celular y frascos) dentro de un gabinete de bioseguridad. Abra ultravioleta (UV) lámpara germicida al menos 1 h del gabinete antes de la obra y apagar la lámpara UV mientras trabajaba activamente en el gabinete. Utilizar guantes, gafas de seguridad y equipos de protección personal y descontaminar la superficie del Banco y pipetas con …

Representative Results

Realizamos microfluídicos biofilm ensayo descrito aquí usando un tipo de salvaje cepa de C. albicans bajo condiciones de dos medios de comunicación (medios RPMI-1640 y araña), la cepa de tipo salvaje en presencia de los conocidos antimicóticos anfotericina B (16 μg/mL) en RPMI, y dos cepas mutantes previamente divulgados a tener defectos en la formación de biopelículas (bcr1Δ/Δ y efg1 Δ/Δ) en los medios de la araña. <p class="jove_content" fo:ke…

Discussion

El ensayo de biofilm microfluídicos personalizable aquí descrito permite la visualización de la formación de biofilm en tiempo real a un nivel unicelular cuando se expone a una tasa fija de flujo laminar y temperatura constante. Proporciona un medio poderoso para el desarrollo de biopelículas en cepas de tipo salvaje y mutantes, y los efectos de los tratamientos de agente antimicrobiano en biofilms bajo condiciones que imitan las condiciones fisiológicas observaron en entornos clínicos. A diferencia de la mayoría…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Nobile para discusiones útiles en ensayos de biofilm. Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de salud (NIH) subsidio AI125801 R21 (C.J.N.). D.L.R. fue apoyado por una Beca doctoral de la Universidad de California y el Instituto para México y los Estados Unidos (UC MEXUS) y el Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).

Materials

BioFlux 1000z Fluxion Automated microfluidic device for live cell analysis
48-well plate 0-20 dyne Fluxion 910-0047 Microfluidic plate
Montage Software Fluxion Version 7.8.4.0 Visualization analysis software
ImageJ Software NIH https://imagej.nih.gov/ij/
Yeast Extract Criterion C7341
Bacto Peptone BD Biosciences 211677
Dextrose (D-Glucose) Fisher Scientific D163
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific P285-500
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
MOPS Sigma-Aldrich M3183
Nutrient Broth Criterion C6471
Difco D-Mannitol BD Biosciences 217020
Agar Criterion C5001
Amphotericin B Corning 30-003-CF
Sterile Inoculating Loops VWR 30002-094
Petri Dishes with Clear Lid Fisher Scientific FB0875712
Disposable Cuvettes Fisher Scientific 14-955-127
Lens Paper VWR 52846-001
Microplate and Cuvette Spectrophotometer BioTek EPOCH2TC
Shaking Incubator Eppendorf M12820004

References

  1. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
  2. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
  3. Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
  4. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
  5. Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
  6. Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
  7. Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
  8. Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
  9. Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
  10. Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
  11. Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
  12. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  13. Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
  14. Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
  15. Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
  16. Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
  17. Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
  18. Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
  19. Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).

Play Video

Cite This Article
Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (130), e56743, doi:10.3791/56743 (2017).

View Video