Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada
Summary
Este protocolo descreve o uso de um dispositivo personalizável microfluidic automatizado para visualizar a formação de biofilmes de Candida albicans sob condições fisiológicas do hospedeiro.
Abstract
Candida albicans é o patógeno mais comum fúngico dos seres humanos, causando cerca de 15% dos casos de infecção hospitalar. Um atributo de grande virulência de c. albicans é sua capacidade de forma de biofilmes, comunidades estruturadas de células anexadas às superfícies bióticas e abióticas. Biofilmes de c. albicans podem formar sobre os tecidos do hospedeiro, tais como camadas da mucosa e em dispositivos médicos, tais como cateteres, marcapassos, próteses e próteses conjuntas. Biofilmes representam desafios clínicos significativos porque eles são altamente resistentes a perturbações físicas e químicas e podem atuar como reservatórios para semente infecções disseminadas. Vários ensaios de em vitro têm sido utilizados para estudar a formação de biofilmes de c. albicans , tais como ensaios de placa de microtitulação, medições de peso seco, ensaios de viabilidade celular e microscopia confocal de varredura do laser. Todos estes ensaios são ensaios de único ponto de extremidade, onde a formação de biofilme é avaliada em um ponto específico de tempo. Aqui, descrevemos um protocolo para estudar a formação de biofilme em tempo real usando um dispositivo automatizado microfluidic sob condições de fluxo laminar. Este método permite a observação da formação de biofilmes como o biofilme se desenvolve ao longo do tempo, usando condições personalizáveis que imitam os do hospedeiro, tais como aqueles encontrados em cateteres vasculares. Este protocolo pode ser usado para avaliar os defeitos de biofilme de mutantes genéticos, bem como os efeitos inibitórios dos agentes antimicrobianos no desenvolvimento do biofilme em tempo real.
Introduction
Candida albicans é um comensal membro a microbiota humana, no entanto, também é um patógeno oportunista, capaz de causar infecções fúngicas superficiais e graves1,2. Uma característica de maior virulência de c. albicans é sua habilidade de forma resiliente e biofilmes resistentes aos medicamentos, comunidades de células aderiram a uma superfície e colocados em uma matriz extracelular material1,3. Biofilmes de c. albicans são altamente estruturados, contendo várias camadas de vários tipos de células (rodada brotamento levedura forma células, as células pseudohyphal ovais e células hifais tubulares)4. Desenvolvimento de biofilmes de c. albicans começa com a adesão de células de levedura-forma redonda para uma superfície (semeando o biofilme), seguida pela proliferação destas células na superfície, e em seguida a maturação do biofilme imaturo estruturar em um totalmente formado o biofilme que está rodeado por matriz extracelular material4. O biofilme maduro é predominantemente composto por células hifais alongadas que formam redes densas e comunicantes, fornecendo a estabilidade arquitetônica para o biofilme4. Durante todo o ciclo de vida do biofilme, leveduras brotamento células dispersarem o biofilme maduro e podem viajar para outras regiões do corpo para causar infecções disseminadas ou semente novas biofilmes em outros sites4,5. C. albicans pode formar biofilmes sobre superfícies bióticas, tais como superfícies mucosas e em todo o tecido do hospedeiro e em superfícies abióticas, tais como cateteres, marcapassos, próteses e articulações protéticas. Devido às propriedades recalcitrantes de biofilmes, que são extremamente difíceis de erradicar, e em muitos casos a estratégia único tratamento eficaz é a remoção do dispositivo infectado4. Assim, é crucial investigar a formação de biofilme em condições semelhantes às observadas em situações clínicas.
Existem várias críticas na vivo modelos animais utilizados para o estudo de c. albicans biofilme formação6,7,8; no entanto, estes estudos podem ser caro e demorado e são limitados pelo número de cepas e agentes antimicrobianos que podem ser testados em um determinado momento. Em vitro biofilme ensaios, por outro lado, permitir a avaliação rápida, elevado-produção de compostos antifúngicos e cepas mutantes e são muito mais cost-effective e ético que ensaios de biofilme transportados para fora no animal modelos9, 10,11,12,13,14. Aqui descrevemos um ensaio em vitro que temos desenvolvido e otimizado para observar a formação de biofilme temporalmente sob fluxo laminar, usando um dispositivo de customizable microfluidic14,15. O ensaio permite a visualização de cada etapa de formação de biofilmes, incluindo a etapa inicial de adesão, proliferação celular, maturação do biofilme e dispersão de célula. O ensaio também é útil para visualizar as alterações de morfologia celular durante o desenvolvimento de um biofilme.
Placas de microtitulação, que são normalmente utilizadas em vitro ensaios de biofilme, enquanto alto throughput, não permito para condições de fluxo controlado. Sistemas de célula tradicional fluxo laminar permitem a avaliação contínua da formação de biofilme em condições de fluxo controlado, mas estas são muitas vezes demoradas para configurar e tendem a ter limitado throughput e controle de faixa dinâmica. O dispositivo microfluidic utilizado aqui supera estas limitações através da combinação de placas de alta taxa de transferência (contendo 48 poços) com uma câmara interna de fluxo laminar e é altamente reprodutível, versátil e personalizável.
Aqui, descrevemos um protocolo para o uso de um dispositivo disponível comercialmente microfluidic automatizado para avaliar a formação de biofilmes de um selvagem-tipo c. albicans Coe, os efeitos de um agente antifúngico conhecido no desenvolvimento de um biofilme e biofilme formação em duas cepas mutantes (bcr1Δ/Δ e efg1 Δ/Δ) que anteriormente foram relatados para ter o biofilme defeitos in vitro e in vivode17,16,18. O protocolo descrito pode ser usado para testar a eficácia de agentes antimicrobianos em inibir a formação de biofilme por meio do desenvolvimento de um biofilme e identificar os genes necessários para o desenvolvimento de biofilme normal selecionando bibliotecas mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de biofilme microfluidic personalizável descrito aqui permite a visualização da formação de biofilme em tempo real em um nível de célula única quando exposto a um fluxo laminar de taxa fixa e a temperatura constante. Ele fornece um meio poderoso para estudar o desenvolvimento de biofilmes em estirpes de tipo selvagem e mutantes, e observaram os efeitos de tratamentos de agente antimicrobiano em biofilmes nas condições que imitam condições fisiológicas em situações clínicas. Ao contrário da maior…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos os membros do laboratório Nobile para discussões úteis sobre ensaios de biofilme. Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de saúde (NIH) grant R21 AI125801 (C.J.N.). DLR foi apoiado por uma bolsa de doutoramento da Universidade de California Institute para o México e os Estados Unidos (UC-MEXUS) e o Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
References
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