Celulares corrientes inducidas por Puff aplicación de GABA en rebanadas de cerebro
Summary
Describimos la técnica de soplo, que reactivos farmacológicos pueden ser administrados durante la grabación de la abrazadera del remiendo de célula entera y resaltar diversos aspectos de las características que son cruciales para su éxito.
Abstract
Administración farmacológica es de uso general cuando se realizan células completas-abrazadera del remiendo en rebanadas de cerebro. Uno de los mejores métodos de aplicación de la droga durante la grabación electrofisiológica es la técnica de soplo, que puede utilizarse para estudiar el efecto de reactivos farmacológicos en actividades neuronales en rebanadas de cerebro. La mayor ventaja del uso del hojaldre es que la concentración del fármaco en el sitio de grabación aumenta rápidamente, evitando así la desensibilización de receptores de membrana. Exitosa aplicación del soplo implica especial atención a los siguientes elementos: la concentración del fármaco, los parámetros de la micropipeta de hojaldre, la distancia entre la punta de una micropipeta de hojaldre y la neurona registrada y la duración y presión conduce el soplo (libras por pulgada cuadrada, psi). Este artículo describe un procedimiento paso a paso para registrar celulares corrientes inducidas por ácido gamma – aminobutírico (GABA) en una neurona de un segmento cortical prefrontal de soplar. En particular, el mismo procedimiento se puede aplicar con pequeñas modificaciones a otras áreas del cerebro como el hipocampo y el striatum y a diferentes preparaciones, tales como los cultivos celulares.
Introduction
La técnica de patch-clamp, una herramienta primaria para la investigación de las señales eléctricas en las neuronas, se desarrolló en la década de 19701,2. Una gran ventaja de esta técnica es que proporciona conocimiento sobre tratamientos específicos cómo (por ejemplo, farmacológicas) pueden alterar las funciones neuronales o canales en tiempo real3. Evaluación farmacológica de la función neuronal durante la grabación en una rebanada del cerebro de células completas requiere la aplicación de fármacos, como agonistas o antagonistas de receptores específicos, las neuronas se registran. Este método permite la identificación de alteraciones neuronales que ocurren después de la aplicación de un medicamento específico, lo que conduce a una mejor comprensión de las propiedades fisiológicas y patológicas de las neuronas4. Aunque la administración farmacológica puede llevarse a cabo mediante perfusión5 o soplo6, este último es la técnica superior. En particular: () aplicación de hojaldre rápido aumenta la droga concentración alrededor de la neurona grabada a un nivel tal que se evita la desensibilización de los receptores de membrana; (ii) el volumen de droga inflado es extremadamente bajo, por lo que hay poco efecto en la solución del baño, que por lo tanto reduce los efectos indeseables de las sustancias químicas administradas en rebanadas de cerebro; (iii) el protocolo de hojaldre puede ser establecido y guardado, haciendo el experimento precisamente reproducible; (iv) puff aplicación representa uso económico de agonistas/antagonistas, especialmente donde tales reactivos son caros o difíciles de conseguir.
Aquí, nos centraremos en la grabación de celulares corrientes inducidas por GABA el soplar en rebanadas de cerebro agudo preparado, una preparación que tiene la ventaja de circuitos cerebrales relativamente bien conservado. Cómo llevamos a cabo corrientes inhibitorios inducidos por el soplo7 se describen en este artículo. Utilizando cesio (Cs+)-soluciones internas y el mantenimiento de las neuronas a 0 mV, presentamos GABA-puff evocado inhibitorias postsynaptic corrientes (eIPSCs) con las características técnicas adecuadas. Utilizando un modelo de ratón de la depresión inducida por lipopolisacárido (LPS) inyección8, se muestra que el eIPSC amplitud evocada por un soplo de GABA se reduce significativamente en rebanadas de ratones inyectados por LPS comparados con el control del vehículo. Nuestra intención es que este artículo debería mostrar cómo la técnica de soplo es ampliamente aplicable a estudios dirigidos a evaluar el efecto de productos químicos, compuestos o drogas sobre actividades neuronales en rebanadas de cerebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicación de hojaldre es ampliamente utilizado para evaluar la función de receptores postsinápticos3,4,7, pero requiere un control preciso en cada experimento. Aquí describimos un procedimiento que implica sujeción parche de células enteras, que demuestra que GABA-puff inducida IPSCs (es decir, eIPSCs) en rebanadas de cerebro cortical prefrontal. La resistencia del electrodo de registro es MΩ cerca de 5, mientras que el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a las siguientes organizaciones: Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31171018, 31171355), la ciencia y la tecnología de división de Guangdong (2013KJCX0054), la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) y Guangzhou ciencia y Technology Bureau (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
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