Geheel-cel stromingen geïnduceerd door Puff toepassing van GABA in de hersenen segmenten
Summary
We beschrijven de bladerdeeg-techniek, waarbij farmacologische reagentia tijdens geheel-cel patch-clamp opname kunnen worden beheerd, en benadrukken verschillende aspecten van de functies die cruciaal voor het succes ervan zijn.
Abstract
Farmacologische beheer wordt vaak gebruikt bij het uitvoeren van geheel-cel patch-clamp opnemen in plakjes van de hersenen. Een van de beste methoden van drug aanvraag tijdens elektrofysiologische opname is de techniek van bladerdeeg, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van farmacologische reagentia op neuronale activiteiten in plakjes van de hersenen. Het grootste voordeel van bladerdeeg toepassing is dat de concentratie van de drug rond de opname site snel verhoogt, waardoor desensibilisatie van membraan receptoren. Succesvol gebruik van bladerdeeg toepassing gepaard gaat met aandacht voor de volgende elementen: de concentratie van het geneesmiddel, de parameters van de micropipet van bladerdeeg, de afstand tussen het uiteinde van een puff-micropipet en het neuron opgenomen, en de duur en Druk het bladerdeeg rijden (pond per vierkante inch, psi). Dit artikel beschrijft een stapsgewijze procedure voor het vastleggen van geheel-cel stromingen geïnduceerd door puffend gamma – aminoboterzuur (GABA) op een neuron van een prefrontale corticale segment. Dezelfde procedure kan met name worden toegepast met kleine wijzigingen aan andere hersengebieden zoals de hippocampus en de striatum en verschillende preparaten, zoals celculturen.
Introduction
De patch-clamp techniek, een primaire hulpmiddel voor het onderzoeken van de elektrische signalen in neuronen, werd ontwikkeld in de jaren 19701,2. Een groot voordeel van deze techniek is dat het geeft kennis over hoe specifieke behandelingen (bijvoorbeeld farmacologische) neuronale functies of kanalen in real-time3kan wijzigen. Farmacologische evaluatie van neuronale functie tijdens geheel-cel opnemen in een segment van de hersenen vereist de toepassing van drugs, zoals agonisten of antagonisten van specifieke receptoren, om de neuronen wordt opgenomen. Met deze methode kunt de identificatie van neuronale veranderingen die zich na toepassing van een specifieke drug voordoen, dus leidt tot een beter begrip van de fysiologische en pathologische eigenschappen van de neuronen4. Hoewel farmacologische administratie kan worden uitgevoerd via beide perfusie5 of bladerdeeg6, is de laatste de superieure techniek. In het bijzonder: (i) bladerdeeg toepassing snel toeneemt drug concentratie rond de opgenomen neuron tot een niveau dat desensibilisatie van het membraan-receptoren wordt verhinderd; (ii) het volume van de drug gepofte is extreem laag, zodat er weinig effect op de bad-oplossing, waardoor dus eventuele ongewenste effecten van de door de overheid gereguleerde chemische stoffen op de hersenen segmenten; (iii) het bladerdeeg-protocol kan worden ingesteld en opgeslagen, waardoor het experiment zeer nauwkeurig worden gereproduceerd; (iv) bladerdeeg toepassing vertegenwoordigt economische hetgebruikvan agonisten/antagonisten, bijzonder wanneer dergelijke reagentia zijn duur of moeilijk te verkrijgen.
Hier, zullen we ons richten op recording geheel-cel stromingen geïnduceerd door puffend GABA in terdege voorbereid hersenen plakjes, een preparaat dat het voordeel van relatief goed bewaard gebleven hersenen circuits heeft. Hoe voeren we bladerdeeg-geïnduceerde remmende stromingen7 zal in dit artikel worden beschreven. Met behulp van cesium (Cs+)-op basis van interne oplossingen en houden van de neuronen op 0 mV, we zullen introduceren GABA-bladerdeeg opgeroepen remmende postsynaptisch stromingen (eIPSCs) met passende technische details. Met behulp van een muismodel van depressie veroorzaakt door lipopolysaccharide (LPS) injectie8, laten we zien dat de eIPSC amplitude opgeroepen door een GABA-bladerdeeg aanzienlijk verminderd in plakjes van LPS-geïnjecteerd muizen in vergelijking met controle van het voertuig. Onze bedoeling is dat dit artikel laten hoe de bladerdeeg techniek breed toepasbaar is aan studies gericht zien moet op de evaluatie van het effect van chemische stoffen, stoffen of geneesmiddelen op neuronale activiteiten in plakjes van de hersenen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bladerdeeg toepassing wordt algemeen gebruikt ter beoordeling van postsynaptisch receptor functie3,4,7, maar vereist nauwkeurige controle in elk experiment. Hier beschrijven we een procedure waarbij geheel-cel patch klemmen, waaruit blijkt hoe dat Gaba-bladerdeeg geïnduceerde IPSCs (bijvoorbeeld eIPSCs) in plakjes van de prefrontale corticale hersenen. De weerstand van de opname-elektrode is ongeveer 5 MΩ, terwijl de tip diame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank de volgende organisaties: nationale Natural Science Foundation van China (31171018, 31171355), de wetenschap en technologie afdeling van Guangdong (2013KJCX0054), de Natural Science Foundation van de Guangdong provincie ( 2014A030313418, 2014A030313440), en Guangzhou wetenschap en technologie Bureau (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
