Summary

זרמים שלמים-תא המושרה על ידי יישום עלים של GABA במוח פרוסות

Published: October 12, 2017
doi:

Summary

אנו מתארים את הטכניקה פאף, שלפיו ריאגנטים תרופתי יכול להינתן במהלך ההקלטה תאים כל תיקון-קלאמפ, להאיר היבטים שונים של תכונות חיוניות להצלחתו.

Abstract

ניהול תרופתי הוא נפוץ בעת עריכת תיקון שלם-תא-הקלטה לפרוסות המוח קלאמפ. אחת השיטות הטובות ביותר של יישום סמים במהלך ההקלטה אלקטרופיזיולוגיות היא הטכניקה פאף, אשר יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של ריאגנטים תרופתי על הפעילות העצבית במוח פרוסות. היתרון הגדול ביותר של יישום פאף הוא כי ריכוז התרופה סביב האתר הקלטה מגביר במהירות, ובכך למנוע הפחתת רגישות של קולטני ממברנה. שימוש מוצלח של יישום עלים כרוך תשומת-לב רבה הרכיבים הבאים: ריכוז התרופה, הפרמטרים של micropipette עלים, המרחק בין הקצה של micropipette עלים, נוירון מוקלט, וכן את משך הזמן ואת הלחץ נהיגה אצלם (פאונד לאינץ ‘ מרובע, psi). מאמר זה מתאר הליך שלב אחר שלב עבור הקלטה זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאמא אמינו בוטירית (GABA) אל נוירון פרוסת קליפת המוח הקדם חזיתית. ראוי לציין, ניתן להחיל את ההליך עם שינויים מזעריים באזורים אחרים במוח כגון ההיפוקמפוס סטריאטום את, תכשירים שונים, כגון תרביות תאים.

Introduction

הטכניקה תיקון-קלאמפ, כלי ראשי עבור חוקרים אותות חשמליים בנוירונים, פותחה בשנות ה-701,2. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא מספקת ידע על טיפולים כמה ספציפית (למשל, תרופתי) רשאית לשנות פונקציות עצביים או ערוצים בזמן אמת3. תרופתי הערכה של תפקוד במהלך הקלטת בפרוסה במוח תאים כל דורש היישום של תרופות, כגון אגוניסטים או היריבים של רצפטורים ספציפיים, כדי הנוירונים מוקלטת. שיטה זו מאפשרת זיהוי שינויים עצביים להתרחש בעקבות בקשה של תרופה ספציפית, ובכך מוביל הבנה טובה יותר של מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים של נוירונים4. למרות ניהול תרופתי יכול להתבצע באמצעות גם זלוף5 או עלים6, האחרון הוא טכניקה מעולה. בפרט: (i) פחזנית יישומים במהירות מגביר סמים ריכוז סביב מוקלטת הנוירון לרמה כזאת הפחתת רגישות של קולטני ממברנה נמנעת; (ii) את עוצמת הקול של סמים נשענתי הוא נמוך ביותר, כך שקיימת השפעה מועטה על הפתרון אמבט, ולפיכך מפחית תופעות בלתי רצויות של הכימיקלים מנוהלת על פרוסות המוח; (iii) פרוטוקול עלים ניתן להגדיר ונשמר, ביצוע הניסוי ברמת דיוק גבוהה ביותר לשחזור; (iv) עלים יישום מייצג שימוש חסכוני אגוניסטים/antagonists, במיוחד כאלה ריאגנטים איפה יקר או קשה להשיג.

כאן, אנו נתמקד להקליט זרמים שלמים-תא המושרה על-ידי נשיפת גאבא פרוסות המוח בחריפות מוכן, הכנה זה יש את היתרון של מעגלים המוח יחסית שמור היטב. התנהלותינו פאף-induced זרמי מעכבות7 שמתואר במאמר זה. באמצעות צסיום (Cs+)-מבוסס פתרונות פנימי, והחזקת הנוירונים ב 0 mV, תציג לנו גאבא. פאף עורר זרמי postsynaptic מעכבות (eIPSCs) עם הפרטים הטכניים המתאימים. באמצעות מודל של העכבר של דיכאון הנגרם על ידי הזרקת ליפופוליסכריד (LPS)8, אנו מראים את eIPSC משרעת עורר על ידי שאיפה גאבא פוחת באופן משמעותי בפרוסות של הזרקת LPS עכברים לעומת הרכב שולט. הכוונה שלנו היא כי מאמר זה צריך להראות איך הטכניקה עלים ישימה באופן נרחב על מחקרים שמטרתם הערכת ההשפעה של כימיקלים, תרכובות או סמים על הפעילות העצבית במוח פרוסות.

Protocol

דיור חיה ובהמה כל הניסויים נערכו בהתאם לנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לחקר בעלי חיים באוניברסיטה רגילה סין דרום, על פי הנחיות חיה אכפת שהוקם על ידי המכון הלאומי של בריאות- 1. ההכנה של פתרונות להכין 500 מל סטנדרטי מלאכותי השדרתי (כלנית חדד) המכיל את הרכיבים שמתואר שלנו עבודה שפורסמה …

Representative Results

הטכניקה עלים מאפשר לחוקרים לחקור את השפעת הסמים על קולטנים מסוימים על פני השטח של נוירון מסוים. במאמר זה, אנו מתמקדים זרמי מתווך על ידי קולטני GABA. איור 1 מציג את micropipettes הקלטה של עלים. כדי למנוע השפעה על נוירונים מוקלטות של הלחץ הפיזי שנוצר על ידי והגראס, חנה…

Discussion

עלים היישום נעשה שימוש נרחב כדי להעריך את קולטן postsynaptic פונקציה3,4,7, אך דורש שליטה מדויקת ניסוי. נתאר כאן הליך לערב שלם-תא תיקון מחבר חובק למעקה, אשר מדגים ש-GABA-פאף המושרה IPSCs (קרי eIPSCs) פרוסות המוח הקדם חזיתית בקליפת המוח. התנגדותם של האלקטרוד?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצה להודות הארגונים הבאים: הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31171018, 31171355), מדע, טכנולוגיה החלוקה של גואנג-דונג (2013KJCX0054), בסיס מדעי הטבע של בפרובינצית גואנג-דונג ( 2014A030313418, 2014A030313440), ואת גואנגג’ואו מדע, טכנולוגיה הלשכה (201607010320).

Materials

Glass Borosilicate micropipettes Shutter Instruments BF150-86-10 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter
Micropipette Puller Shutter Instruments MODEL P-97  Flaming/Brow Micropipette Puller
Micromanipulators Shutter Instruments MP-285
Computer controlled Amplifier    Molecular Devices Multiclamp 700B
Digital Acquisition system  Molecular Devices Digidata 1440A
Imaging Camera Nikon  2115001 Inspection equipment
Microscopy  Nikon  Eclipse FN1 
Master 8 A.M.P.I. Master-8 Pulse stimulator
Vibratome Slicer Leica VT 1000S
Picospritzer Ⅲ Parker Hannifin Pressure Systems for Ejection of
Picoliter Volumes in Cell Research
Razor blade Gillette 74-S FLYING EAGLE
Video monitor Panasonic WV-BM 1410
502 Glue Deli 7146 Cyanoacrylate Glue
Peristaltic pump Shanghai JIA PENG Corporation BT100-1F
Video Camera Olympus America Medical OLY-150
Transfer Pipets Biologix 30-0138A1

References

  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

Play Video

Cite This Article
Feng, Y., Tang, B., Chen, M., Yang, L. Whole-cell Currents Induced by Puff Application of GABA in Brain Slices. J. Vis. Exp. (128), e56387, doi:10.3791/56387 (2017).

View Video