Поклеточного течения индуцированных слоеного применение ГАМК в мозге ломтиками
Summary
Мы описываем слоеного технику, в которой может осуществляться во время записи поклеточного патч зажим фармакологических реагентов и выделить различные аспекты функций, которые имеют решающее значение для его успеха.
Abstract
Фармакологических администрация обычно используется при проведении поклеточного патч зажим запись в срезах головного мозга. Один из лучших методов применения препарата во время электрофизиологических записи является метод слоеного, который может использоваться для изучения влияния фармакологических реагентов на нейрональных деятельности в срезах головного мозга. Самое главное преимущество слоеного приложения является, что концентрации препарата вокруг сайта записи увеличивается быстро, таким образом предотвращая десенсибилизации мембранных рецепторов. Успешное использование слоеного приложения включает в себя пристальное внимание на следующие элементы: концентрация препарата, параметры слоеного микропипеткой, расстояние между кончиком микропипеткой слоеного и Записанная нейрон и продолжительность и вождения слоеные давления (фунтов на квадратный дюйм, psi). Эта статья описывает пошаговые процедуры для записи поклеточного течения индуцированных пыхтя гамма – аминомасляная кислота (ГАМК) на нейрон ломтиком префронтальной коры головного мозга. В частности та же процедура может применяться с незначительными изменениями в других областях мозга, таких как гиппокамп и Полосатое тело и различные препараты, такие как клеточных культур.
Introduction
Патч зажим технику, основным инструментом для исследования электрических сигналов в нейронах, был разработан в 1970-х1,2. Основным преимуществом этого метода является, что она предоставляет знания о как конкретные процедуры (например, фармакологической) может изменить функции нейронов или каналов в реальном времени3. Фармакологических оценки нейрональных функции во время поклеточного запись в срез мозга требует применения препаратов, таких как агонисты и антагонисты специфических рецепторов, записывается нейронов. Этот метод позволяет выявлять нейрональных изменений, которые происходят после применения конкретного препарата, что приводит к более глубокому пониманию физиологических и патологических свойства нейронов4. Хотя фармакологических администрация может проводиться через либо перфузии5 или слоеного6, последний является превосходной техникой. В частности: (i) слоеного приложения быстро увеличивается наркотиков концентрацию вокруг записанные нейрона до уровня таким образом, чтобы предотвратить десенсибилизации мембранных рецепторов; (ii) объем наркотиков пыхтел крайне низка, так что есть мало влияет на раствор для ванн, который таким образом уменьшает любые нежелательные эффекты химических веществ, управляемых на срезах головного мозга; (iii) протокола слоеного можно задать и сохранить, делая эксперимента очень точно воспроизводимый; (iv) слоеного приложения представляет собой экономичное использование агонистов/антагонистов, особенно когда такие реагенты дорогих или трудно получить.
Здесь мы сосредоточимся на запись поклеточного течения индуцированных пыхтя ГАМК в прекрасно подготовленных мозга ломтиками, препарат, который имеет преимущество относительно хорошо сохранились мозга цепей. В этой статье будут описаны как мы проводим слоеного индуцированной ингибирующее течений7 . С помощью цезий (Cs+)-на основе внутреннего решения и проведение нейронов в 0 mV, мы будем вводить ГАМК слоеного вызывали тормозной постсинаптический токов (eIPSCs) с соответствующие технические детали. С помощью мыши модели депрессии, вызванных инъекции липополисахарида (LPS)8, мы показывают, что eIPSC амплитуды, вызываемые ГАМК слоеного значительно уменьшается в ломтики LPS-вводят мышей, по сравнению с контроля автотранспортных средств. Наше намерение заключается, что эта статья должна показать как слоеного техника широко применяется к исследования, направленные на оценку воздействия любых химических веществ, соединений или наркотиков на нейрональных деятельности в срезах головного мозга.
Protocol
Representative Results
Discussion
Слойка приложение широко используется для оценки постсинаптических рецепторов функция3,4,7, но требует точного управления в каждом эксперименте. Мы опишем здесь процедура поклеточного патч зажима, который демонстрирует, что ГАМК слоен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить следующих организаций: национальные естественные науки фонд Китая (31171018, 31171355), Наука и технологии Отдела Гуандун (2013KJCX0054), фонд естественных наук из провинции Гуандун ( 2014A030313418, 2014A030313440), Гуанчжоу науки и технологического бюро (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
