Célula inteira correntes induzidas pela aplicação de Puff de GABA no cérebro fatias
Summary
Descrevemos a técnica de sopro, pelo qual reagentes farmacológicos podem ser administrados durante a gravação de células inteiras remendo-braçadeira e destacam vários aspectos dos recursos que são cruciais para seu sucesso.
Abstract
Administração farmacológica é comumente usada quando conduzindo a célula inteira remendo-braçadeira gravação em fatias de cérebro. Um dos melhores métodos de aplicação da droga durante a gravação eletrofisiológica é a técnica de sopro, que pode ser usada para estudar o efeito dos reagentes farmacológicos na actividade neuronal em fatias de cérebro. A maior vantagem do aplicativo de sopro é que a concentração do fármaco em torno do local de gravação aumenta rapidamente, evitando assim a dessensibilização de receptores de membrana. Envolve a utilização bem sucedida da aplicação de sopro cuidadosa atenção aos seguintes elementos: a concentração da droga, os parâmetros da micropipeta de sopro, a distância entre a ponta de uma micropipeta de sopro e o neurônio gravada e a duração e pressão dirigindo o puff (libras por polegada quadrada, psi). Este artigo descreve um procedimento passo a passo para a gravação de células inteiras correntes induzidas pelo ácido gama – aminobutírico (GABA) para um neurônio de uma fatia de cortical pré-frontal de sopro. Notavelmente, o mesmo procedimento pode ser aplicado com pequenas modificações para outras áreas do cérebro como o hipocampo e o corpo estriado e diferentes preparações, tais como culturas de células.
Introduction
A técnica da remendo-braçadeira, uma ferramenta principal para investigar sinais elétricos nos neurônios, foi desenvolvida na década de 1970,1,2. Uma grande vantagem desta técnica é que ele fornece conhecimento sobre tratamentos específicos como (por exemplo, farmacológico) podem alterar funções neuronais ou canais em tempo real3. Avaliação farmacológica da função neuronal durante a gravação em uma fatia do cérebro células inteiras requer a aplicação de drogas, tais como agonistas ou antagonistas dos receptores específicos, para os neurônios sendo gravada. Este método permite a identificação de alterações neuronais que ocorrem após a aplicação de uma droga específica, conduzindo assim a uma melhor compreensão das propriedades dos neurônios4fisiológicas e patológicas. Embora a administração farmacológica pode ser realizada através de qualquer perfusão5 ou sopro6, o último é a técnica superior. Em particular: (i) soprar o aplicativo rapidamente aumenta de droga concentração ao redor do neurônio gravado para um nível tal que a dessensibilização dos receptores de membrana é impedida; (ii) o volume de droga inchado é extremamente baixo, para que haja pouco efeito sobre a solução de banho, o que reduz, portanto, quaisquer efeitos indesejáveis das substâncias químicas administradas em fatias do cérebro; (iii) o protocolo de sopro pode ser definido e salvo, tornando a experiência muito precisamente reprodutíveis; (iv) sopro aplicativo representa o uso econômico dos agonistas/antagonistas, particularmente onde tais reagentes são caros ou difíceis de obter.
Aqui, nos concentraremos na gravação de células inteiras de correntes induzidas por sopro GABA em fatias de cérebro perfeitamente preparados, uma preparação que tem a vantagem de circuitos cerebrais relativamente bem preservada. Como conduzimos induzida por sopro inibitório correntes7 serão descritos neste artigo. Usando o césio (Cs+)-com base em soluções internas e segurando os neurônios em 0 mV, apresentaremos GABA-sopro evocado correntes pós-sináptico inibitórias (eIPSCs) com detalhes técnicos apropriados. Usando um modelo do rato da depressão induzida pela injeção de lipopolissacarídeo (LPS)8, mostramos que o eIPSC amplitude evocada por um sopro de GABA é significativamente reduzida em fatias de ratos LPS-injetados em comparação aos controles do veículo. Nossa intenção é que este artigo deve mostrar como a técnica de sopro é amplamente aplicável a estudos que visam avaliar o efeito de drogas, compostos ou produtos químicos na actividade neuronal em fatias de cérebro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aplicação de sopro é amplamente utilizada para avaliar a função de receptor pós-sináptico3,4,7, mas requer um controle preciso em cada experimento. Descrevemos aqui um procedimento envolvendo células inteiras remendo de aperto, que demonstra o que Puff GABA induzida IPSCs (i.e., eIPSCs) em fatias de cérebro cortical pré-frontal. A resistência do eletrodo gravação é cerca de 5 MΩ, enquanto o diâmetro da ponta de M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer as seguintes organizações: Nacional Natural Science Foundation da China (31171018, 31171355), a ciência e a tecnologia de divisão de Guangdong (2013KJCX0054), a Fundação ciência Natural da província de Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440) e a ciência de Guangzhou e tecnologia Bureau (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
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