पूरे सेल धाराओं मस्तिष्क स्लाइस में गाबा के कश आवेदन द्वारा प्रेरित
Summary
हम कश तकनीक का वर्णन है, जिसके द्वारा औषधीय एजेंट पूरे सेल पैच-दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान प्रशासित किया जा सकता है, और सुविधाओं है कि इसकी सफलता के लिए महत्वपूर्ण है के विभिंन पहलुओं पर प्रकाश डाला ।
Abstract
औषधीय प्रशासन आमतौर पर प्रयोग किया जाता है जब पूरे सेल पैच-दबाना मस्तिष्क स्लाइस में रिकॉर्डिंग का आयोजन । electrophysiological रिकॉर्डिंग के दौरान दवा आवेदन का सबसे अच्छा तरीकों में से एक कश तकनीक है, जो मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन्स गतिविधियों पर औषधीय रिएजेंट के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । कश आवेदन का सबसे बड़ा लाभ यह है कि रिकॉर्डिंग साइट के आसपास दवा एकाग्रता तेजी से बढ़ जाती है, इस प्रकार झिल्ली रिसेप्टर्स के नुकसान को रोकने. पफ आवेदन के सफल प्रयोग निम्नलिखित तत्वों के लिए सावधान ध्यान शामिल है: दवा की एकाग्रता, पफ micropipette के मापदंडों, एक कश micropipette की नोक और ंयूरॉन के बीच की दूरी दर्ज की गई, और अवधि और दबाव (प्रति वर्ग इंच पाउंड, साई) कश ड्राइविंग । यह आलेख वर्णन करता है कि पूरे सेल धाराओं एक अग्रिम cortical टुकड़ा के एक ंयूरॉन पर गामा aminobutyric एसिड (गाबा) puffing द्वारा प्रेरित रिकॉर्डिंग के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया । विशेष रूप से, एक ही प्रक्रिया ऐसे हिप्पोकैंपस और striatum के रूप में अंय मस्तिष्क क्षेत्रों में मामूली संशोधनों के साथ लागू किया जा सकता है, और सेल संस्कृतियों के रूप में विभिंन तैयारी, ।
Introduction
पैच-दबाना तकनीक, न्यूरॉन्स में विद्युत संकेतों की जांच के लिए एक प्राथमिक उपकरण, 1970 के दशक में विकसित किया गया था1,2. इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह कैसे विशिष्ट उपचार (जैसे, औषधीय) पर ज्ञान प्रदान करता है ंयूरॉन कार्यों या वास्तविक समय में चैनल3बदल सकते हैं । एक मस्तिष्क टुकड़ा में पूरे सेल रिकॉर्डिंग के दौरान न्यूरॉन समारोह के औषधीय मूल्यांकन एगोनिस्ट या विशिष्ट रिसेप्टर्स के विरोधी के रूप में दवाओं के आवेदन की आवश्यकता है, न्यूरॉन्स दर्ज किया जा रहा. इस विधि ंयूरॉन परिवर्तन है कि एक विशिष्ट दवा के बाद आवेदन हो की पहचान की अनुमति देता है, इस प्रकार के शारीरिक और रोग के गुणों की एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी4ंयूरॉंस । हालांकि औषधीय प्रशासन या तो छिड़काव5 या पफ6के माध्यम से आयोजित किया जा सकता है, बाद बेहतर तकनीक है । विशेष रूप से: (i) पफ आवेदन तेजी से बढ़ जाता है के चारों ओर दवा एकाग्रता दर्ज की ंयूरॉन एक स्तर पर ऐसी है कि झिल्ली रिसेप्टर्स की संवेदनशीलता को रोका; (ii) मादक द्रव्यों की मात्रा बहुत कम है, इसलिए है कि स्नान के समाधान पर थोड़ा प्रभाव है, जो इसलिए मस्तिष्क के स्लाइस पर प्रशासित रसायनों के किसी भी अवांछनीय प्रभाव कम कर देता है; (iii) कश प्रोटोकॉल सेट और बचाया जा सकता है, प्रयोग बहुत ठीक प्रतिलिपि बनाने; (iv) कश आवेदन एगोनिस्ट के किफायती उपयोग का प्रतिनिधित्व करता है/विशेष रूप से, जहां इस तरह के रिएजेंट महंगे है या प्राप्त करने के लिए मुश्किल है ।
यहां, हम तीव्रता से तैयार मस्तिष्क स्लाइसें, एक तैयारी है कि अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क सर्किट का लाभ दिया है में गाबा puffing द्वारा प्रेरित पूरे सेल धाराओं रिकॉर्डिंग पर ध्यान केंद्रित करेंगे । हम कश प्रेरित निरोधात्मक धाराओं कैसे आचरण7 इस लेख में वर्णित किया जाएगा । सीज़ियम का उपयोग करके (Cs+)-आंतरिक समाधान आधारित है, और 0 एमवी पर ंयूरॉंस पकड़, हम गाबा-पफ निरोधात्मक postsynaptic धाराओं (eIPSCs) के साथ उचित तकनीकी जानकारी पैदा शुरू होगा । lipopolysaccharide (एलपीएस) इंजेक्शन8द्वारा प्रेरित अवसाद के एक माउस मॉडल का उपयोग करना, हम बताते हैं कि एक गाबा पफ द्वारा पैदा eIPSC आयाम काफी एलपीएस के स्लाइस में कम है-वाहन नियंत्रण की तुलना में चूहों इंजेक्शन. हमारा इरादा यह है कि इस लेख दिखाना चाहिए कि कैसे कश तकनीक व्यापक रूप से किसी भी रसायनों, यौगिकों या मस्तिष्क स्लाइस में ंयूरॉंस की गतिविधियों पर दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से अध्ययन के लिए लागू है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पफ आवेदन व्यापक रूप से postsynaptic रिसेप्टर फंक्शन3,4,7का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन प्रत्येक प्रयोग में सटीक नियंत्रण की आवश्यकता है । हम यहां एक पूरे-स…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक निंनलिखित संगठनों का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा: चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३११७१०१८, ३११७१३५५), गुआंग्डोंग (2013KJCX0054) के विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रभाग, गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन ( 2014A030313418, 2014A030313440), और गुआंगज़ौ विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो (२०१६०७०१०३२०) ।
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
- Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33 (2012).
- Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, 1163-1178 (2007).
- Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
- Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
- Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
- Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
- Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
- Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
- Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).
