Forskning om joniserande strålning (IR)-inducerad clonogenic celldöd är viktigt för att förstå effekterna av IR på maligna tumörer och normal vävnad. Här, vi beskriver en one-step analys för att bedöma den stora leveranssätt IR-inducerad clonogenic celldöd baserat på Morfologi av 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI)-missfärgade kärnor visualiseras genom fluorescensmikroskopi.
Forskning om joniserande strålning (IR)-inducerad clonogenic celldöd är viktigt för att förstå effekten av IR på maligna tumörer och normal vävnad. Här beskriver vi en snabb och kostnadseffektiv one-step analysen för att samtidigt bedöma den stora leveranssätt clonogenic celldöd induceras av IR, dvs, apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras. Den här metoden är celler som odlas på ett täckglas bestrålas med röntgen och färgas med 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI). Använda fluorescensmikroskopi, identifieras apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras utifrån de karakteristiska morfologier av DAPI-färgade atomkärnor. Apoptos bestäms av förekomsten av apoptotiska kroppar (dvs, kondenserad och fragmenterade kärnor). Mitotisk katastrof bestäms av förekomsten av atomkärnor som uppvisar två eller flera separata lober och mikrokärnor. Cellulärt åldrande bestäms av förekomsten av åldras-associerad heterochromatic foci (dvsnuclear DNA som innehåller 30-50 ljusa, tät foci). Detta tillvägagångssätt gör att försöksledaren att enkelt skärmen för clonogenic cell death lägen med olika cellinjer, behandling inställningar eller tidpunkter, med målet att klarlägga mekanismerna för celldöd i målceller och villkor av intresse.
Joniserande strålning (IR) inducerar flera lägen av clonogenic celldöd. Forskning om IR-inducerad clonogenic celldöd är viktigt för att förstå toxicitet av IR för normala vävnader, samt för att utveckla metoder för att öka cancer strålbehandling behandlingseffekt. Apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras är den stora leveranssätt clonogenic celldöd induceras av IR1. Apoptos är en reglerad celldöd som initieras av DNA skada1. Mitotisk katastrof är celldöd som uppstår p.g.a. avvikande Mitos följd oreparerade DNA dubbel-strand raster1. Cellulära åldras definieras som ett tillstånd av irreversibel cell tillväxt gripandet2; Observera att cellulära åldras inte är celldöd per se, men det är ett clonogenic celldöd eftersom det avskaffar den senescent cellen clonogenic överlevnad.
Olika cellbaserade analyser har utvecklats för att individuellt bedöma apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras. Apoptos kan bedömas genom terminal deoxynucleotidyl transferas dUTP nick-slutet märkning (TUNEL) färgning, annexin V färgning, DNA-fragmentering analyser och sub-G1 cellcykeln fas bestämning av flöde flödescytometri1. Mitotisk katastrof kan bedömas genom immunofluorescens färgning för mitotiska markörer, inklusive MPM2, TUNEL färgning och elektronmikroskopi1. Cellulära åldras kan bedömas av åldras-associerade β-galaktosidas (SA-β-Gal) färgning, tillväxt-gripande analyser och elektronmikroskopi1. Ännu viktigare, det dominerande läget clonogenic celldöd skiljer sig bland cellinjer och behandling inställningar3,4. Därför, för att belysa övergripande profilen clonogenic celldöd för en viss experimentella inställning, flera analyser som omfattar alla dessa lägen dödens måste utföras tillsammans, vilket är labor – och kostnadsintensiv.
I den här artikeln beskriver vi en snabb och kostnadseffektiv one-step analysen för att samtidigt bedöma apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras induceras av IR3,4. Den här metoden är celler som odlas på ett täckglas bestrålas med röntgen och färgas med 4′, 6-diamidin-2-fenylindol dihydroklorid (DAPI). Använda fluorescensmikroskopi, identifieras apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras varje utifrån de respektive karakteristiska morfologier av DAPI-färgade atomkärnor. Denna strategi kommer att vara användbart för program inklusive screening för clonogenic cell death profiler i olika cellinjer, behandling inställningar och tidpunkter, med målet att undersöka mekanismerna för celldöd i målceller och villkoren för intresse.
Kritiska steg i protokollet är följande. Det första bör celler odlas på kultur skålen som en enskiktslager eftersom genomför en morfologisk bedömning av DAPI-färgade kärnor är svårt för multilayered celler. För detta ändamål, i steg 2,9, rekommenderas noggrann överföring av kultur skålen till en inkubator. skakningar i kultur skålen genererar en virvel av suspenderade celler som leder till koncentrationen av celler i mitten av kultur skålen. Dessutom bör overconfluence som leder till multilayered celler undvikas. För detta ändamål, i steg 2,7, kan antalet celler seedade på kultur skålen ändras baserat på befolkningen fördubbling tid och intervallet mellan bestrålning och fixering. Ett sammanflöde av ungefärligt 80 vid tidpunkten för fixering rekommenderas. Andra, hastighet är viktigt i fixering och DAPI färgning (dvs, steg 4 och 5). Inter prov inkonsekvens när det gäller tiden för dessa steg kan leda till heterogenitet i DAPI signalintensitet i kärnor, som skulle dölja morfologiska bedömningen.
Antalet täckglas i en enda kultur maträtt kan ökas i steg 2.2, högst fyra täckglas kan placeras i en 35 mm maträtt, och numret kan ökas ytterligare med större rätter. Placera flera täckglas i varje kultur rätt kan den effektiva driften av tid kursen bedömning för en viss behandling (dvs, omslaget följesedlar kan samlas in från en kultur maträtt en på flera punkter av intresse).
I steg 3,2, kan bestrålning dosen modifieras enligt forskarnas intresse. Tillämpningen av en enhetlig dos på flera cellinjer möjliggör jämförelse av känsligheten för varje läge clonogenic celldöd bland cellinjer. Däremot, möjliggör användning av iso-clonogenic överlevnad doser för varje cellinje jämförelse av clonogenic cell death profiler bland cellinjer. Iso-clonogenic överlevnad dosen kan bestämmas av de clonogenic överlevnad assay12. Värdet10 D, den dos som ger 10% clonogenic överlevnad, är en gemensam slutpunkt för iso-clonogenic överlevnad dos.
I steg 3.3, kan tiden från bestrålning till fixering modifieras enligt forskarnas intresse. Detta är viktigt eftersom den topp tid för IR-inducerad apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras varierar cellinje och behandling. I denna artikel, vi använde 72 h efter bestrålning som den tidpunkt som skulle vara mest användbar för den inledande screeningen av clonogenic cell death profiler, baserat på flera studier av vår grupp och andra beskrivs enligt följande1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-stråle-inducerad apoptos i celler etablerat från solida tumörer oftast inträffar några dagar efter bestrålning. (ii) X-stråle-inducerad mitotisk katastrof i cancerceller uppstår mest framträdande på den andra eller tredje Mitos efter frisläppandet från den tillfälliga cellcykelarrest induceras av bestrålning. Release inträffar vanligtvis cirka 24 h efter bestrålning, följt av upprepade mitoser med intervall på cirka 24 h. (iii) X-ray – inducerad cellulära åldras blir uppenbart efter ett intervall som är beroende av raden för cellen i fråga: 2 dagar efter bestrålning för vissa tidiga fall och 7 dagar efter bestrålning för de flesta cellinjer. Efter att få en helhetsbild av cellen clonogenic död profiler från den inledande screeningen, tid kursen experiment kommer att ge en mer detaljerad klargörande av den topp tid för varje clonogenic celldöd i specifika cellinje eller skick ränta4.
Det bör noteras att den DAPI färgning assay och clonogenic överlevnad analysen, en guldmyntfot metod för strålning känslighet bedömning, inte är utbytbara. Apoptos och mitotisk katastrof bara pågå i timmar. Således upptäcker den DAPI färgning assay för en given tidpunkt apoptos och mitotisk katastrof som inträffar vid tidpunkten för bedömningen. Resultaten av clonogenic överlevnad assay däremot, vid en given tidpunkt punkt innehålla det totala beloppet av apoptos och mitotisk katastrof som hade inträffat under inkubationstiden för vanligtvis 10-14 dagar efter bestrålning. Olika från apoptos och mitotisk katastrof, senescent celler kvar på kultur skålen; de ackumuleras successivt över tiden efter bestrålning. Därför resultaten från både den DAPI färgning assay och clonogenic överlevnad analysen speglar den totala mängden åldras som inträffade under inkubationstiden. Ännu viktigare, andelen av apoptos, mitotisk katastrof och åldras induceras av bestrålning varierar kraftigt enligt cell linje och bestrålning dos. Sammantaget teoretiskt, resultaten av en analys inte kan översättas direkt till de andra analysens.
Den DAPI färgning assay har några begränsningar. Först, det fortfarande kontroversiellt huruvida mitotisk katastrof är en distinkt läge av celldöd. I fältet i strålningsbiologi anses mitotisk katastrof en stor läge av IR-inducerad celldöd som skiljer sig från andra mekanismer clonogenic cell death1. Däremot, hävdar andra att mitotisk katastrof inte är en distinkt läge av celldöd utan snarare en process som föregår celldöd inklusive apoptos och nekros13,14. Således, apoptos och mitotisk katastrof kan överlappa i viss utsträckning. Andra, tidigare studier tyder på att cellulära åldras kan uppstå i avsaknad av SAHF i vissa cellinjer och behandling inställningar2. På nuvarande, andra analyser som utformats speciellt för varje clonogenic cell bör death-läge användas att öka robustheten i slutsatserna från ett visst experiment. För det tredje kan inte den DAPI färgning assay bedöma lägen clonogenic celldöd än apoptos, mitotisk katastrof och cellulära åldras (t.ex., nekros och autofagi). För det fjärde har nyttan av den DAPI färgning assay som en prediktor för tumör svar på strålbehandling inte klargjorts i kliniken. Från denna synpunkt är clonogenic överlevnad analysen, som bedömer den totala mängden clonogenic celldöd, överlägsen den DAPI färgning assay eftersom ett samband har påvisats mellan SF2, den överlevande fraktionen av celler som bestrålas med 2 Gy Röntgen, och tumör svar på strålbehandling15. Det är dock anmärkningsvärt att clonogenic överlevnad analysen inte används allmänt i kliniken, främst på grund av kravet på en hög grad av kompetens och en lång tidsperiod (dvs.14 dagar) för datainsamling. I jämförelse, förfarandet för den DAPI färgning assay är enklare och tar betydligt kortare tid, cirka 3-4 dagar, för att generera resultat. Nyttan av DAPI färgningenanalysen som en prediktor för tumör svar på strålbehandling kommer att testas i kliniken inom en snar framtid.
Sammanfattningsvis är det DAPI färgning assay en kostnadseffektiv one-step analys att samtidigt bedöma de tre stora lägen av IR-inducerad clonogenic celldöd. Detta tillvägagångssätt gör att man kan enkelt skärm för lägena av clonogenic celldöd för olika cellinjer, behandling inställningar och tidpunkter, med målet att klarlägga mekanismerna för celldöd i målceller och villkor av intresse.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar fru Akiko Shibata för tekniskt bistånd. Detta arbete stöds av Grants-in-Aid från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan för program för ledande forskarskolor, odla globala ledare inom tunga Ion Therapeutics och teknik.
cover slip | Matsunami | C013001 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
trypsin | Wako | 201-16945 | |
inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
square culture dish | Corning | 431110 | |
slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
oil | Olympus | N5218600 | |
CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
chloroform | Wako | 035-02616 |