JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
癌症研究

One-Step Protocol voor evaluatie van de wijze van straling veroorzaakte de Clonogenic celdood door fluorescentie microscopie

Published: October 23, 2017
doi:
10.3791/56338
, , ,
1Department of Radiation Oncology,Gunma University Graduate School of Medicine, 2Advanced Scientific Research Leaders Development Unit,Gunma University Graduate School of Medicine

Summary

Onderzoek naar ioniserende straling (IR)-de dood van de cel van de geïnduceerde clonogenic is belangrijk voor het begrijpen van de effecten van IR op tumoren en normale weefsels. Hier beschrijven we een one-step-assay voor het beoordelen van de belangrijkste wijzen van clonogenic IR-veroorzaakte celdood op basis van morfologie van 4′, 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI)-gekleurd kernen gevisualiseerd door fluorescentie microscopie.

Abstract

Onderzoek naar ioniserende straling (IR)-de dood van de cel van de geïnduceerde clonogenic is belangrijk voor het begrijpen van het effect van IR op tumoren en normale weefsels. Hier beschrijven we een snelle en kosteneffectieve one-step-assay voor het gelijktijdig het beoordelen van de belangrijkste wijzen van clonogenic celdood geïnduceerd door IR, dat wil zeggen, apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie. Bij deze methode zijn de cellen geteeld op een cover slip bestraald met x-stralen en gekleurd met 4′, 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI). Met behulp van fluorescentie microscopie, worden apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie geïdentificeerd op basis van de karakteristieke morphologies van de DAPI gebeitste kernen. Apoptosis wordt bepaald door de aanwezigheid van apoptotic organen (d.w.z., verkorte en gefragmenteerde kernen). Mitotische catastrofe wordt bepaald door de aanwezigheid van kernen die twee of meer afzonderlijke lobben en micronuclei vertonen. Cellulaire senescentie wordt bepaald door de aanwezigheid van senescentie-geassocieerde hétérochromatique foci (d.w.z.nucleair DNA met 30-50 lichte, dichte foci). Deze benadering biedt de experimentator te gemakkelijk scherm voor clonogenic cel dood modi met behulp van verschillende cellijnen, behandelsettings, en/of tijdstippen, met het doel van het ophelderen van de mechanismen van celdood in de doelcellen en de voorwaarden van belang.

Introduction

Ioniserende straling (IR) induceert meerdere modi van de dood van de cel van de clonogenic. Onderzoek naar de dood van de cel van de IR-geïnduceerde clonogenic is belangrijk voor het begrijpen van de toxiciteit van IR aan normale weefsels, alsmede voor de ontwikkeling van methoden om de doeltreffendheid van de behandeling van kanker radiotherapie. Apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie zijn de belangrijke modi van de dood van de cel clonogenic geïnduceerd door IR1. Apoptosis is een gereguleerde manier van celdood die wordt geïnitieerd door DNA schade1. Mitotische catastrofe is de dood van de cel die optreedt als gevolg van afwijkende mitose als gevolg van herstelde DNA dubbele-strand einden1. Cellulaire senescentie wordt gedefinieerd als een staat van onomkeerbare cel groei arrestatie2; Merk op dat cellulaire senescentie niet per se celdood is, maar het is een wijze van de dood van de cel van de clonogenic omdat het schaft het voortbestaan van de clonogenic van de verouderend cel.

Verschillende cel-gebaseerde testen zijn ontwikkeld voor het individueel beoordelen apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie. Apoptosis kan worden geëvalueerd door de terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) kleuring, Annexine V kleuring DNA fragmentatie testen en sub-G1 celcyclus fase bepaling door stroom cytometry1. Mitotische catastrofe kan worden beoordeeld door immunofluorescentie kleuring voor mitotische markeringen, met inbegrip van MPM2, TUNEL kleuring en elektronenmicroscopie1. Cellulaire senescentie kan worden beoordeeld door senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-Gal) kleuring, groei-arrestatie testen en elektronenmicroscopie1. Nog belangrijker is, is de overheersende wijze van de dood van de cel van de clonogenic verschilt onder cellijnen en behandeling instellingen3,4. Daarom, om te verhelderen van het algehele profiel van de dood van de cel van clonogenic voor een bepaalde experimentele instelling, meerdere tests rekening houdend met alle van de volgende modi van de dood moeten plaatsvinden samen, die – en kosten-arbeidsintensief is.

In dit artikel beschrijven we een snelle en kosteneffectieve one-step-assay voor het gelijktijdig ramingskosten van apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie geïnduceerd door IR3,4. Bij deze methode zijn de cellen geteeld op een cover slip bestraald met x-stralen en gekleurd met 4′, 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI). Met behulp van fluorescentie microscopie, worden apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie elk geïdentificeerd op basis van de respectieve karakteristiek morphologies van de DAPI gebeitste kernen. Deze aanpak zal zitten nuttig voor toepassingen met inbegrip van screening voor clonogenic cel dood profielen in verschillende cellijnen behandelsettings en tijdstippen, met het doel van het onderzoek naar de mechanismen van celdood in de doelcellen en de voorwaarden van belang.

Protocol

1. voorbereiding van materialen autoclaaf cover slips. Cover slips in een bekerglas van glas plaatsen. Dek het bekerglas af van glas met folie. Autoclaaf bij 121 ° C op 15 psi 20 min. Droog bij 50 ° C. Store bij kamertemperatuur in een cultuur kap. Bereiden fixatie oplossing: 3% paraformaldehyde + 2% sucrose in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Om een glazen fles van 1000 mL, voeg 700 mL PBS en 30 g paraformaldehyde. Let op: Paraformaldehyde is corrosief, Draag geschikte handsch onen. Los paraformaldehyde volledig door verhitting tot 80 ° C, met behulp van een magnetron. Let op: Paraformaldehyde dampen zijn giftig, draag een masker. Laat op kamertemperatuur ‘s nachts. Toevoegen van 20 g sacharose. Toevoegen PBS te maken van het totale volume 1 L. Aliquot in 50 mL tubes. Fixatie oplossing kan worden opgeslagen voor 3 jaar bij-20 ° C of voor 3 maanden bij 4 ° C. 2. Voorbereiding van celkweek Opmerking: deze procedures moeten worden uitgevoerd in een cultuur kap. Cultuur en passage U2OS menselijke Osteosarcoom cellen om logaritmische groei 5. Opmerking: Andere celtypes kunnen worden gebruikt na het bepalen van de optimale bestraling dosis. Veeg een scalpel met papieren handdoeken bevochtigd met 70% ethanol. Met behulp van de scalpel, plaats een cover slip op een 35 mm schotel voor de cultuur van de cel (hierna gewoon aangeduid als " de schotel "). Opmerking: Het aantal cover slips in één schotel kan worden verhoogd op basis van de experimentele ontwerp (zie discussie). Add 1 mL voedingsbodems: DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum. Opmerking: Andere media kan worden gebruikt volgens de gekozen celtype. Veeg pincet met keukenpapier vochtig met 70% ethanol. Met behulp van de verlostang, zachtjes houdt het midden van de cover slip. De media van de cultuur van de schotel volledig, gecombineerd met behoud van een greep op de cover slip. ​ Opmerking: deze stap bevordert immobilisatie van de cover slip op de dish. Losmaken van aanhangend gekweekte cellen met behulp van trypsine 5. Voedingsbodems van de schotel gecombineerd. Voeg 1 mL PBS toe en schud de schotel voorzichtig. Gecombineerd PBS van de schotel. 1 mL trypsine [0.25w/v% EDTA trypsine-1mmol/L] aan het gerecht toevoegen. Incubate gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO 2. 9 mL cultuurmedia toevoegen aan het gerecht. Met behulp van een 1000 μL micropipet, maak een suspensie van eencellige. Tellen de cellen 5. In een buis 1,5 mL, Voeg 0,9 mL celsuspensie en 0,1 mL 0,4% Trypan blauw oplossing. Toepassing 10 μL aan een hemocytometer. Het aantal onderzoeken onbevlekt (d.w.z., live) cellen onder een Microscoop omgekeerd-fase. In een tube van 15 mL, bereiden 3 mL celsuspensie in kweekmedia bij een dichtheid van 0,5 x 10 5 cellen/mL. Opmerking: Cel dichtheid kan worden gewijzigd volgens experimentele nodig (Zie discussie). Voorzichtig, voeg 2 mL van de celsuspensie op de dish. Incubate’s nachts bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO 2. 3. Bestraling Let op: het verwerken van de irradiator van de X-ray zorgvuldig volgens de fabrikant ' s instructies. Onderzoeken de cellen onder een Microscoop omgekeerd-fase. Bevestigen dat de cellen zijn gekoppeld aan de cover slip en levend. Het bestralen van de schotel met 6 Gy x-stralen (1.4 Gy/min, 300 KVP, 20 mA). Incubate gedurende 72 uur bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO 2. Opmerking: Incubatietijd kan worden gewijzigd volgens de experimentele ontwerp (Zie discussie). 4. Fixatie cultuur media uit de schotel gecombineerd. Met de schaar, knip het uiteinde van een 1.000 μL micropipet tip 5 mm van het einde. Opmerking: De gesneden tip helpt soepel toepassen van de fixatie oplossing. Met behulp van de gesneden tip, voeg 1 mL fixatie oplossing (bereid in stap 1.2) aan de schotel van de zijwand van de schotel. Opmerking: Deze stap is tijdgevoelig en dient daarom te worden uitgevoerd zonder micropipet tips bij de verwerking van meerdere monsters. Toepassing van fixatie oplossing direct naar de onderkant van de schotel kan de cellen beschadigen. Zet de schotel in een vierkante cultuur schotel. Schud de vierkante cultuur schotel voorzichtig om de fixatie oplossing gelijkmatig verdelen over de cover slip. Incubate gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Fixatie-oplossing gecombineerd van de schotel. Voeg toe 2 mL PBS op de schotel uit de zijwand van de schotel. Opmerking: Toepassing van PBS rechtstreeks naar de onderkant van de schotel kan de cellen beschadigen. Gecombineerd PBS van de schotel. Herhaal stap 4.7 en 4.8 tweemaal . Opmerking: De schotel kan worden opgeslagen voor 1 week bij 4 ° C met de stukjes van de cover badend in 2 mL PBS. 5. DAPI kleuring een dia glas, van toepassing zijn 5 μl 1 μg/mL DAPI kleuring reagens. Opmerking: De DAPI kleuring reagens is stabiel voor 6 maanden wanneer opgeslagen beschermd tegen licht op of onder de -20 ° C. De cover slip met behulp van een scalpel, verwijderen uit de schotel. Trekken uit de overtollige PBS op de cover slip door het aanraken van de rand van de slip van de cover met een papieren handdoek. Mount de cover slip ondersteboven op de daling van de DAPI kleuring reagens op het glas van de dia, zodat de cellen worden blootgesteld aan DAPI kleuring reagens. Opmerking: Deze stap is tijdgevoelig. Drogen van de DAPI kleuring reagens kan leiden tot suboptimaal kleuring. De monsters kunnen worden opgeslagen voor 1 jaar bij -20 ° C. 6. Afbeelding van overname onderzocht het monster op een fluorescentie Microscoop. Kernen worden gevisualiseerd met behulp van de filter van de DAPI. Opmerking: Hetzij een 20 X of een 60 X olie lens kan worden gebruikt, volgens de onderzoeker ' s belang. Bij het gebruik van een 60 X olie lens, voeg een druppel olie op de cover slip. Wees voorzichtig dat de monsters niet raak de lens; anders, de lens kan worden beschadigd. Beelden van kernen met behulp van een CCD camera en digitale afbeelding acquisitie software met de volgende instellingen en parameters te verwerven: DAPI filter, enkelgelaagde beelden, winst van 1 X, en automatische belichting. Afwerking beeld overname: veeg de 20 X lens met keukenpapier vochtig met lens cleaner. Veeg de 60 X olie lens met papieren handdoeken met chloroform bevochtigd. 7. Evaluatie van Clonogenic cel dood modus In willekeurig geselecteerde beelden, het aantal kernen die voldoen aan de criteria voor apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie totdat het totale aantal getelde kernen 300 tot. Uitvoeren van deze stap in drievoud voor elke experimentele instelling. Criteria voor apoptosis: aanwezigheid van apoptotic organen (d.w.z., verkorte en gefragmenteerde kernen) 6 , 7. Criteria voor mitotische catastrofe: aanwezigheid van kernen tonen van twee of meer afzonderlijke lobben of micronuclei 8 , 9 , 10. Criteria voor cellulaire senescentie: aanwezigheid van senescentie-geassocieerde hétérochromatique foci (SAHF) (d.w.z. nucleair DNA met 30-50 lichte, dichte foci) 2 , 11.

Representative Results

Als voorbeeld, werden U2OS menselijke Osteosarcoom cellen behandeld met 6 Gy x-stralen, 72 uur ge¨ uncubeerd, en onderworpen aan de DAPI kleuring assay volgens het protocol. Figuur 1 toont de ingezoomde beelden voor de typische nucleaire morphologies gekoppeld apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie verkregen met behulp van een 60 × olie lens. Verwijzen naar de stappen 7.1.1-7.1.3 voor de karakteristieke morphologies voor elke toestand van de dood van de cel van de clonogenic. Figuur 2 toont overzicht beelden van kernen verkregen met behulp van een 20 X zoomlens. Bestraling met 6 Gy x-stralen geïnduceerde mitotische ramp vaak, minder vaak apoptosis en cellulaire senescentie zelden. Op deze manier op een laag-vergroting veld onderzoek maakt het mogelijk om vatten in één oogopslag het totaalbeeld van de clonogenic cel dood profiel in een bepaalde experimentele setting. Figuur 3 ziet u een grafische weergave van de gekwantificeerde gegevens. Figuur 1: beelden van de DAPI gebeitste kernen met typische morphologies van apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie ingezoomd. U2OS cellen werden bestraald met 6 Gy x-stralen. Na 72 uur, werden de cellen vast en gekleurd met DAPI. Nucleaire beelden werden verkregen met behulp van een 60 X olie lens. Schaal bar = 20 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2: overzicht beelden van DAPI gebeitste kernen van cellen behandeld met röntgenstralen. U2OS cellen werden bestraald met 6 Gy x-stralen of mock-bestraald. Na 72 uur, werden de cellen vast en gekleurd met DAPI. Beelden van kernen werden verkregen met behulp van een 20 X zoomlens. Cirkels, apoptosis; pijlen, mitotische catastrofe. Schaal bar = 50 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: gekwantificeerde gegevens voor apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie geïnduceerd in cellen die zijn behandeld met röntgenstralen. U2OS cellen werden bestraald met 6 Gy x-stralen of mock-bestraald. Na 72 uur, werden de cellen vast en gekleurd met DAPI. Beelden van kernen werden verkregen met behulp van een 20 X zoomlens. Uit willekeurige velden, een totaal van 300 kernen werden geëvalueerd voor apoptosis (Ap), mitotische catastrofe (MC) en cellulaire senescentie (Sns). De evaluaties werden uitgevoerd in drievoud. Gemiddelde waarden worden weergegeven, en foutbalken geven standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

De kritische stappen in het protocol zijn als volgt. Eerst, cellen moeten worden gekweekt op de schotel van cultuur als een enkelgelaagde omdat het uitvoeren van een morfologische analyse van DAPI gebeitste kernen moeilijk voor meerdere lagen cellen is. Te dien einde in stap 2.9, is zorgvuldige overdracht van de cultuur-schotel naar een incubator aanbevolen; schudden van de cultuur-schotel genereert een werveling van zwevende cellen die tot de concentratie van cellen in het midden van de cultuur-schotel leidt. Bovendien, moet overconfluence leiden tot meerdere lagen cellen worden vermeden. Te dien einde in stap 2.7, kan het aantal cellen ontpit op de cultuur schotel worden gewijzigd op basis van de populatie verdubbeling van tijd en het interval tussen de bestraling en fixatie. Een samenloop van ongeveer 80 ten tijde van de fixatie wordt aanbevolen. Ten tweede, is snelheid belangrijk voor fixatie en DAPI kleuring (d.w.z., stap 4 en 5). Inter monster inconsistentie met betrekking tot de termijnen voor deze stappen kan leiden tot heterogeniteit in de DAPI signaalsterkte in de kernen, die de morfologische beoordeling verhullen zou.

In stap 2.2, kan het aantal cover slips in een enkele cultuur schotel worden verhoogd; een maximum van vier cover slips kan worden geplaatst in een schotel van 35 mm, en het aantal kan verder worden verhoogd met behulp van grotere gerechten. Meerdere cover slips in elke cultuur schotel plaatsen kunt de efficiënte werking van tijd cursus beoordeling voor een bepaalde behandeling (dat wil zeggen, de hoes glijdt kunnen worden verzameld van een cultuur schotel één voor één op meerdere tijdstippen van belang).

Bij stap 3.2, kan de dosis van de bestraling worden gewijzigd volgens de onderzoekers belang. De toepassing van een consistente dosis op meerdere cellijnen kan de vergelijking van de gevoeligheid voor elke modus van de dood van de cel van clonogenic onder de cellijnen. Aan de andere kant, maakt het gebruik van iso-clonogenic overleven doses voor elke cel regel vergelijking van clonogenic cel dood profielen onder de cellijnen. De iso-clonogenic overleven dosis kan worden bepaald door de clonogenic overleven assay12. De D-waarde10 , de dosis die 10% clonogenic overleven biedt, is een gemeenschappelijk eindpunt voor de iso-clonogenic overleven dosis.

In stap 3.3, kan de tijd tussen bestraling fixatie worden gewijzigd volgens de onderzoekers belang; Dit is belangrijk omdat de piek tijd voor IR-veroorzaakte apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie is afhankelijk van de cellijn en behandeling. In dit artikel, we gebruikten 72 h na bestraling als het tijdstip dat zou nuttigst voor de eerste screening van clonogenic cel dood profielen, op basis van meerdere studies door onze fractie en anderen beschreven als volgt1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-Vleug-veroorzaakte apoptosis in cellen vastgesteld van solide tumoren meestal een paar dagen na bestraling plaatsvindt. (ii) X-Vleug-geïnduceerde mitotische catastrofe in kankercellen gebeurt meest prominent op de tweede of derde mitose na vrijlating uit de tijdelijke celcyclus arrestatie geïnduceerd door bestraling van. De release gebeurt meestal ongeveer 24 uur na bestraling, gevolgd door herhaalde tussen intervallen van ongeveer 24 h. (iii) X-Vleug-geïnduceerde cellulaire senescentie wordt duidelijk na een interval afhankelijk van de betrokken cellijn: 2 dagen na bestraling voor sommige vroege gevallen, en de 7 dagen na bestraling voor meeste cellijnen. Na het verkrijgen van een totaalbeeld van de clonogenic-cel dood profielen uit de eerste screening, tijd cursus experimenten zorgt voor een meer gedetailleerde opheldering van de piek tijd voor elke toestand van dood van de cel van de clonogenic in de specifieke cellijn en/of toestand van belang4.

Opgemerkt moet worden dat de DAPI kleuring assay en de bepaling van de overleving clonogenic, een methode van de gouden standaard voor straling gevoeligheid beoordeling, zijn niet uitwisselbaar. Apoptosis en de mitotische ramp slechts duren uren. Dus, detecteert de DAPI kleuring assay voor een bepaald tijdstip apoptosis en mitotische catastrofe die op het tijdstip van de beoordeling plaatsvindt. Aan de andere kant, assay de resultaten van het voortbestaan van clonogenic op een bepaald moment punt omvatten het totale bedrag van apoptosis en de mitotische catastrofe die hebben plaatsgevonden tijdens de incubatieperiode voor meestal 10-14 dagen na bestraling. Verschillende van apoptosis en mitotische catastrofe, verouderend cellen blijven op de schotel van cultuur; zij accumuleren geleidelijk in de tijd na bestraling. De resultaten van zowel de DAPI kleuring assay en de bepaling van de overleving clonogenic weerspiegelen derhalve de totale hoeveelheid senescentie die hebben plaatsgevonden tijdens de incubatieperiode. Nog belangrijker is, het aandeel van apoptosis, mitotische catastrofe en senescentie geïnduceerd door bestraling van verschilt volgens cel lijn en bestraling dosis. Tezamen, theoretisch, kunnen niet de resultaten van een test worden omgezet direct die van de andere bepaling.

De DAPI kleuring assay heeft een paar beperkingen. Ten eerste, het blijft controversieel of mitotische catastrofe een aparte manier van celdood is. Op het gebied van straling biologie, mitotische catastrofe wordt beschouwd als een belangrijke vorm van IR-veroorzaakte celdood die verschilt van andere mechanismen van clonogenic cel dood1. Aan de andere kant, argumenteren anderen dat mitotische catastrofe is niet een aparte modus van celdood, maar eerder een proces dat voorafgaat aan de dood van de cel met inbegrip van apoptosis en de necrose13,14. Dus, apoptosis en de mitotische catastrofe kunnen overlappen elkaar tot op zekere hoogte. Tweede, vorige studies suggereren dat cellulaire senescentie bij gebrek aan SAHF in sommige cellijnen en behandeling instellingen2 optreden kan. Aanwezig, andere testen, speciaal ontworpen voor elke cel clonogenic moet dood modus worden gebruikt te verhogen van de robuustheid van de conclusies van een gegeven experiment. Ten derde, de DAPI kleuring assay kan niet beoordelen vervoerswijzen clonogenic celdood dan apoptosis, mitotische catastrofe en cellulaire senescentie (bijvoorbeeldnecrose en autophagy). Ten vierde heeft het nut van de DAPI kleuring assay als voorspeller van tumor reactie op radiotherapie niet is toegelicht in de kliniek. Vanuit dit oogpunt is de clonogenic overleven assay, die het totale bedrag van de dood van de cel van de clonogenic beoordeelt, superieur aan de DAPI kleuring assay omdat een correlatie tussen SF2, de overlevende Fractie van cellen bestraald met 2 Gy is vastgesteld X-stralen, en de reactie van de tumor op radiotherapie15. Het is echter opmerkelijk dat de bepaling van de overleving clonogenic niet wijd in de kliniek, voornamelijk als gevolg van de eis voor een hoge mate van deskundigheid en een lange periode van tijd (d.w.z., 14 dagen) wordt gebruikt voor data-acquisitie. Ter vergelijking: de procedure voor de DAPI kleuring assay is eenvoudiger en kost aanzienlijk minder tijd, ongeveer 3-4 dagen, om resultaten te genereren. Het nut van de DAPI kleuringassay als voorspeller van tumor reactie op radiotherapie zal worden getest in de kliniek in de nabije toekomst.

Kortom is de DAPI kleuring assay een kosteneffectieve one-step test gelijktijdig beoordelen de drie belangrijke takken van clonogenic IR-veroorzaakte celdood. Deze aanpak maakt het mogelijk om gemakkelijk het scherm voor de modi van de dood van de cel van clonogenic voor verschillende cellijnen, behandelsettings en tijdstippen, met het doel van het ophelderen van de mechanismen van celdood in de doelcellen en de voorwaarden van belang.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken mevrouw Akiko Shibata voor technische bijstand. Dit werk werd gesteund door Grants-in-Aid van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan voor programma’s voor toonaangevende gediplomeerde scholen, cultiveren van wereldleiders in zware Ion Therapeutics en Engineering.

Materials

cover slip Matsunami C013001
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-1KG
sucrose Sigma-Aldrich 84097-250G
phosphate-buffered saline Cosmo Bio 16232000
scalpel Kai Medical No.20, 520-A
35 mm cell culture dish Falcon 353001
trypsin Wako 201-16945
inverted phase microscope Shimazu 114-909
X-ray irradiator Faxitron Bioptics Faxitron RX-650
square culture dish Corning 431110
slide glass Matsunami Pro-11
DAPI staining reagent Cell Signaling 8961S
fluorescence microscope Nikon ECLIPSE Ni
fluorescence microscope DAPI filter Nikon U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
fluorescence microscope lens (20×) Nikon Plan Apo λ 20X/0.75
fluorescence microscope lens (60×, oil) Nikon Plan Apo λ 60X/1.40 oil
oil Olympus N5218600
CCD camera Nikon DS-Qi2
digital image acquisition software Nikon NIS-Elements Document
lens cleaner Olympus OT0552
chloroform Wako 035-02616
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
  2. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
  3. Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
  4. Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
  5. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
  6. Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
  7. Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
  8. Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
  9. Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
  10. Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
  11. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
  13. Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
  14. Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
  15. Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).

Tags

Radiation-induced Clonogenic Cell DeathFluorescence MicroscopyDAPI StainingCell Death ModesRadiation BiologyCell CultureX-ray IrradiationFixationCell AttachmentCell Suspension

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kobayashi, D., Shibata, A., Oike, T., Nakano, T. One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56338, doi:10.3791/56338 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image