פרוטוקול בשלב אחד עבור הערכת המצב של מוות של תאים Clonogenic קרינה הנגרמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ
Summary
מחקר על קרינה מייננת (IR)-מוות של תאים clonogenic המושרה חשוב להבנת השפעת IR על גידולים ממאירים ורקמות נורמלי. כאן, אנו מתארים וזמינותו של צעד אחד לשם הערכת המצבים העיקריים של מוות של תאים clonogenic IR-induced בהתבסס על המורפולוגיה של 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי)-צבעונית גרעינים דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.
Abstract
מחקר על קרינה מייננת (IR)-מוות של תאים clonogenic המושרה חשוב להבנת השפעת IR על גידולים ממאירים ורקמות נורמלי. כאן, אנו מתארים וזמינותו בשלב אחד מהירה וחסכונית להערכת דרכי מוות של תאים clonogenic הנגרמת על ידי אינפרא-אדום, קרי, אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בו זמנית. בשיטה זו, תאים גדל על מכסה מוקרן עם צילומי רנטגן, מוכתם 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי). באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הסלולר מזוהים על סמך את מורפולוגיות האופיינית של גרעינים שהוכתמו דאפי. אפופטוזיס נקבעת על ידי הנוכחות של גופים אפופטוטיים להיפגע (קרי, גרעין האטום מרוכז ומתפרקת). קטסטרופה mitotic נקבעת על ידי הנוכחות של הגרעינים כי התערוכה שניים או יותר האונות נפרדות, micronuclei. הזדקנות ביולוגית הסלולר נקבעת על ידי הנוכחות של הזדקנות ביולוגית-הקשורים heterochromatic מוקדים (קרי, DNA גרעיני המכיל 30-50 בהיר, צפופה מוקדים). גישה זו מאפשרת הנסיין על המסך בקלות עבור clonogenic תא מוות מצבי שימוש שונים שורות תאים, טיפול הגדרות, ו/או נקודות זמן, עם המטרה של שחקרתי את המנגנונים של מוות של תאים התאים היעד ואת תנאי הריבית.
Introduction
קרינה מייננת (IR) גורם מספר מצבי clonogenic של מוות של תאים. מחקר על מוות של תאים clonogenic IR-induced חשוב להבנת הרעילות של IR רקמות רגילה, כמו גם לפתח שיטות כדי להגדיל את יעילות הטיפול של הקרנות סרטן. אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות תאית ביולוגית הם המצבים העיקריים של מוות של תאים clonogenic הנגרמת על-ידי אינפרא-אדום1. אפופטוזיס הוא מצב מוסדר של מוות של תאים זה הוא שיזם DNA נזק1. קטסטרופה mitotic היא מוות של תאים המתרחשת עקב חריגה מיטוזה הנובע DNA לא מתוקן כפול-strand מעברי1. הזדקנות ביולוגית הסלולר מוגדרת כמצב של צמיחה בלתי הפיך לתא מעצר2; שימו לב כי הזדקנות ביולוגית הסלולר אינה מוות תאי כשלעצמה, אבל זה מצב של מוות של תאים clonogenic בגלל זה מבטל את הישרדות clonogenic של התא senescent.
מבחני מבוססת תא שונים פותחו כדי להעריך באופן אינדיבידואלי אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הסלולר. אפופטוזיס יכול להיות מוערך על ידי טרמינל deoxynucleotidyl טרנספראז dUTP ניק-end תיוג (TUNEL) מכתים, annexin V מכתים, מבחני פרגמנטציה של ה-DNA ונחישות sub-G1 מחזור התא שלב cytometry זרימה1. קטסטרופה mitotic יכול להיות מוערך על ידי immunofluorescence מכתים לסמני mitotic, כולל MPM2, TUNEL מכתים מיקרוסקופ אלקטרונים1. הזדקנות ביולוגית הסלולר יכול להיות מוערך על ידי צביעת הזדקנות ביולוגית-הקשורים β-galactosidase (SA-β-גל), מבחני צמיחה-מעצרו ו מיקרוסקופ אלקטרונים1. חשוב לציין, מצב הדומיננטית של מוות של תאים clonogenic שונה בין שורות תאים וטיפול-הגדרות-3,–4. לכן, להבהיר לפרופיל הכללי של מוות של תאים clonogenic עבור סביבה נסיוני נתון, מספר מבחני המכסה את כל המצבים הללו של מוות שחייבת להתנהל ביחד, וזו העבודה ואת עלות-עתירי.
במאמר זה, אנו מתארים וזמינותו בשלב אחד מהירה וחסכונית להערכת בו-זמנית אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הסלולר הזדקנות ביולוגית הנגרמת על ידי IR3,4. בשיטה זו, תאים גדל על מכסה מוקרן עם צילומי רנטגן, מוכתם 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי). באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הסלולר אחד מזוהים על סמך את מורפולוגיות האופיינית בהתאמה של גרעינים שהוכתמו דאפי. גישה זו תהיה שימושית עבור יישומים כולל הקרנה של clonogenic תא מוות פרופילים שונים שורות תאים, טיפול והגדרות נקודות זמן, במטרה לחקור את המנגנונים של מוות של תאים התאים היעד ואת תנאי ריבית.
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, תאים צריך לגדול על המנה תרבות כמו טפט כי ביצוע הערכה מורפולוגית של גרעינים שהוכתמו דאפי קשה עבור תאים מרובה שכבות. למטרה זו, בשלב 2.9, מומלץ להעביר זהיר של המנה תרבות לאינקובטור; רעד של המנה תרבות יוצר מערבולת של תאים מושעה שמוביל הריכוז של תאים במרכז המנה תרבות. בנוסף, יש להימנע overconfluence המוביל לתאים מרובה שכבות. למטרה זו, בשלב 2.7, מספר התאים נזרע על המנה תרבות יכול להיות שונה בהתבסס על האוכלוסייה מכפילה את מרווח הזמן בין הקרנה קיבוע וזמן. זרימה של 80 בזמנו של קיבעון מומלץ. שנית, מהירות חשוב הקיבעון, דאפי מכתים (קרי, שלבים 4 ו- 5). חוסר עקביות בין דוגמה לגבי הזמן שנדרשו עבור השלבים יכול להוביל הטרוגניות בעוצמת האות דאפי בתוך האטום, אשר יטשטש את ההערכה מורפולוגי.
בשלב 2.2, ניתן להגדיל את מספר שער גולשת בקערה תרבות; מספר מרבי של ארבע שער גולשת ניתן להניח בקערה 35 מ מ, המספר יכול להיות גדל עוד יותר באמצעות מנות גדולות יותר. הצבת מספר שער גולשת בכל צלחת תרבות מאפשרת את הפעולה יעיל של הזמן קורס הערכה לטיפול נתון (קרי, השער מתעודות משלוח ניתן לאסוף מתוך תרבות קערה אחת בנקודות זמן מרובים עניין).
בשלב 3.2, ניתן לשנות את המינון הקרנה לפי ריבית החוקרים. היישום מינון עקבי שורות תאים מרובים מאפשר השוואת רגישות כל מצב של מוות של תאים clonogenic בין הקווים התא. מצד שני, השימוש של מינונים הישרדות iso-clonogenic עבור כל קו תא מאפשרת השוואה של פרופילים מוות תא clonogenic בין הקווים התא. המינון הישרדות iso-clonogenic יכול להיקבע על ידי וזמינותו להישרדות12clonogenic. הערך10 D, מינון מספק 10% clonogenic הישרדות, היא נקודת קצה של נפוצות עבור המנה הישרדות iso-clonogenic.
בשלב 3.3, הזמן של הקרנה קיבוע ניתן לשנות לפי ריבית החוקרים; זה חשוב כי הזמן. השיא IR-induced אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic של הזדקנות ביולוגית הסלולר משתנה על פי שורת התאים וטיפול. במאמר זה, השתמשנו 72 h לאחר הקרנה כנקודת זמן זה יהיה שימושי ביותר עבור ההקרנה הראשונית clonogenic תא מוות הפרופילים, בהתבסס על מחקרים רבים על ידי הקבוצה שלנו ותיאר אחרים כדלקמן1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-ray-induced אפופטוזיס בתאים נוצרו מגידולים מוצקים בעיקר מתרחשת כמה ימים לאחר הקרנה. (ii) X-ray-induced קטסטרופה mitotic בתאי סרטן מתרחשת בולטת השנייה או השלישית מיטוזה לאחר שחרורו מן המעצר זמני מחזור התא המושרה על ידי הקרנה. השחרור מתרחשת בדרך כלל כ- 24 שעות לאחר הקרנה, ולאחר מכן על-ידי mitoses חוזרות ונשנות במרווחים של 24 ח’ (iii) X-ray-induced הזדקנות ביולוגית הסלולר הופך לברור לאחר מרווח זמן תלוי שורת התאים המדובר: 2 ימים לאחר הקרנה על כמה מקרים מוקדם, ו 7 ימים לאחר הקרנה עבור רוב שורות תאים. לאחר קבלת תמונה כוללת של התא clonogenic מוות פרופילים של ההקרנה הראשונית, זמן הקורס ניסויים תספק הבהרה מפורטת יותר של הזמן. השיא עבור כל מצב של מוות של תאים clonogenic שורת תאים מסוים ו/או תנאי עניין4.
יצוין, כי דאפי מכתים assay ואת וזמינותו להישרדות clonogenic, שיטה תקן הזהב להערכת רגישות לקרינה, אינם ניתנים להחלפה. אפופטוזיס ולאסון mitotic רק להימשך שעות. לפיכך, דאפי מכתים assay עבור נקודת זמן נתון מזהה ואפופטוזיס ו mitotic קטסטרופה המתרחשת בנקודת הזמן של המבדק. מצד שני, התוצאות של הישרדות clonogenic assay בזמן נתון נקודת לכלול את הסכום הכולל של אפופטוזיס ועל mitotic האסון שהתרחש בזמן תקופת הדגירה של בדרך כלל 10-14 ימים לאחר הקרנה. שונה מן אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic, התאים senescent להישאר על המנה תרבות; הם להצטבר בהדרגה לאורך זמן לאחר הקרנה. לכן, התוצאות של שניהם דאפי מכתים assay ואת וזמינותו להישרדות clonogenic משקפים את הסכום הכולל של הזדקנות ביולוגית שאירעו במהלך תקופת הדגירה. חשוב לציין, שחלקן של אפופטוזיס mitotic קטסטרופה, הזדקנות ביולוגית הנגרמת על ידי הקרנה משתנה מאוד לפי תא במינון קו והקרנה. יחדיו, באופן תיאורטי, התוצאות של assay אחד יכול להיתרגם ישירות לאלה של אחרים וזמינותו.
דאפי מכתים assay יש מספר מגבלות. קודם כל, זה נשאר שנוי במחלוקת אם אסון mitotic הוא מצב מובהק של מוות של תאים. בתחום של קרינה הביולוגיה, קטסטרופה mitotic נחשב מצב הגדולות הנוצרות על-ידי אינפרא-אדום של מוות של תאים זה נבדל מנגנונים אחרים של מוות של תאים clonogenic1. מצד שני, אחרים טוענים שאותו אסון mitotic אינה מצב מובהק של מות תאים אלא דווקא תהליך המופיע לפני מות תאים כולל13,של אפופטוזיס ועל נמק-14. לפיכך, אפופטוזיס ולאסון mitotic ייתכן חופפים במידה מסוימת. השני, הקודם מחקרים מראים כי הזדקנות ביולוגית הסלולר יכול להתרחש בהיעדר SAHF כמה שורות תאים וטיפול הגדרות2. -מבחני הנוכחי, שתוכנן במיוחד עבור כל תא clonogenic מצב המוות אמור לשמש כדי להגביר את היציבות של המסקנות של ניסוי נתון. שלישית, דאפי מכתים assay לא יכול להעריך מצבים של מוות של תאים clonogenic שאינם אפופטוזיס, קטסטרופה mitotic או הסלולר הזדקנות ביולוגית (למשל, נמק, autophagy). רביעית, השירות של דאפי מכתים assay כמנבאת גידול בתגובה הקרנות יש לא כבר מבואר במרפאה. מנקודת המבט הזו, וזמינותו להישרדות clonogenic, הבודק את הסכום הכולל של מוות של תאים clonogenic, עדיפה דאפי מכתים assay כי מתאם הקימה בין SF2, השבר ששרד של תאים מוקרן עם 2 Gy צילומי רנטגן, וגם התגובה הגידול הקרנות15. עם זאת, ראוי לציין כי וזמינותו להישרדות clonogenic לא מנוצל באופן נרחב במרפאה, בעיקר בשל הדרישה רמה גבוהה של מומחיות, תקופה ארוכה של זמן (כלומר, 14 ימים) עבור רכישת נתונים. לשם השוואה, ההליך דאפי מכתים assay פשוט יותר, לוקח באופן משמעותי פחות זמן, כ 3-4 ימים, כדי להפיק תוצאות. השירות של ההכתמה דאפיassay כמנבאת גידול בתגובה הקרנות ייבדק במרפאה בעתיד הקרוב.
לסיכום, דאפי מכתים assay הוא הנועד חסכונית בשלב אחד בו זמנית להעריך שלושה מצבים עיקריים של מוות של תאים clonogenic IR-induced. גישה זו מאפשרת על המסך בקלות עבור המצבים של מוות של תאים clonogenic שורות תאים שונים, טיפול הגדרות של נקודות זמן, עם המטרה של שחקרתי את המנגנונים של מוות של תאים התאים היעד ואת תנאי הריבית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים גברת אקיקו Shibata לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי Grants-in-Aid מ משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה של יפן לתוכניות המובילות בוגר בתי הספר, טיפוח מנהיגי הכללית הרפוי יון כבדים, הנדסת.
Materials
| cover slip | Matsunami | C013001 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
| phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
| scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
| 35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
| trypsin | Wako | 201-16945 | |
| inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
| X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
| square culture dish | Corning | 431110 | |
| slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
| DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
| fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
| fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
| fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
| oil | Olympus | N5218600 | |
| CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
| lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
| chloroform | Wako | 035-02616 |
References
- Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
- Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
- Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
- Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
- Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
- Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
- Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
- Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
- Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
- Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
- Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
- Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
- Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).
