Summary

Одношаговая протокол для оценки режима радиационно индуцированных колониеобразования клеточной смерти по микроскопии флуоресцирования

Published: October 23, 2017
doi:

Summary

Исследования по ионизирующего излучения (IR)-смерть клетки искусственного колониеобразования имеет важное значение для понимания воздействия ИК на злокачественные опухоли и нормальных тканей. Здесь мы описываем одношаговый assay для оценки основных видов ИК индуцированной колониеобразования смерти клетки основанный на словотолковании по 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI)-окрашенных ядер, Визуализация по микроскопии флуоресцирования.

Abstract

Исследования по ионизирующего излучения (IR)-смерть клетки искусственного колониеобразования имеет важное значение для понимания воздействие ИК на злокачественные опухоли и нормальных тканей. Здесь мы описываем быстрый и экономически эффективный одношаговый пробирного одновременно оценки основных видов колониеобразования клеточной смерти, вызванных ИК, т.е., апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения. В этом методе клетки, выращенных на крышку выскальзования облученного с рентгеновским излучением и витражи с 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI). С помощью микроскопии флуоресцирования, апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения определяются на основании характерных морфологии DAPI-окрашенных ядер. Апоптоз определяется наличием apoptotic тела (то есть, конденсированной и фрагментации ядер). Митотической катастрофе определяется наличие ядер, которые демонстрируют два или более отдельных лепестков и микроядер. Клеточного старения определяется наличием очагов старение связанные гетерохроматиновые (т.е., ядерной ДНК, содержащие 30-50 яркие, плотные очаги). Этот подход позволяет экспериментатору легко экран для режимов смерти клетки колониеобразования с использованием различных клеточных линий, параметры лечения и/или моменты времени, с целью выяснения механизмов гибели клеток в клетки-мишени и условий, представляющих интерес.

Introduction

Ионизирующего излучения (IR) индуцирует несколько режимов колониеобразования клеточной смерти. Исследование на ИК индуцированной колониеобразования клеточной смерти имеет важное значение для понимания токсичность ИК для нормальных тканей, а также для разработки методов повышения эффективности лечения лучевой терапии рака. Основные режимы колониеобразования клеточной смерти, вызванных ИК1апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения. Апоптоз — это регулируется режим смерти клетки, которое инициируется ДНК повреждения1. Митотической катастрофе — смерть клетки, происходит из-за ошибочной митоз, обусловленных неустраненный двухнитевые разрывы ДНК1. Клеточного старения определяется как состояние необратимых клеток роста арест2; Обратите внимание, что сотовой старение не является смерть клетки per se, но это режим колониеобразования клеточной смерти, потому что он отменяет колониеобразования выживания стареющей клетки.

Различные анализы на основе ячеек были разработаны индивидуально оценить апоптоза, митотической катастрофе и клеточного старения. Апоптоз может оцениваться терминала deoxynucleotidyl трансферазы dUTP Ник конце маркировки (TUNEL) окрашивание, annexin V окрашивание, анализов фрагментация ДНК и суб G1 клеточного цикла этап определения потока цитометрии1. Митотической катастрофе может оцениваться иммунофлюоресценции, пятнать для митотическая маркеров, в том числе MPM2, TUNEL окрашивание и электронной микроскопии1. Клеточного старения можно оценить путем пятнать связанные старения β-галактозидазы (SA-β-Gal), роста арест анализов и электронной микроскопии1. Важно отметить, что преобладающим режим смерти клетки колониеобразования отличается среди клеточных линий и лечения параметры3,4. Таким образом чтобы разъяснить общий профиль колониеобразования клеточной смерти для данной экспериментальной установки, несколько анализов, охватывающий все эти режимы смерти должны проводиться вместе, которая является трудоемким и стоимости.

В этой статье мы опишем быстрый и экономически эффективный одношаговый пробирного одновременно оценки апоптоза, митотической катастрофе и клеточного старения, вызванного ИК3,4. В этом методе клетки, выращенных на крышку выскальзования облученного с рентгеновским излучением и витражи с 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI). С помощью микроскопии флуоресцирования, апоптоз, митотической катастрофе и клеточного старения каждый определяются на основании соответствующих характерных морфологии DAPI-окрашенных ядер. Этот подход будет полезен для приложений, включая скрининг колониеобразования клеток смерть профилей в различных клеточных линий, обработки параметров и моменты времени, с целью изучения механизмов гибели клеток в клетки-мишени и условий интерес.

Protocol

1. Подготовка материалов скользит крышка автоклава. Место крышку скользит в стеклянный стакан. Покрытия стеклянный стакан с фольгой. Автоклаве при температуре 121 ° C на 15 psi для 20 мин Сухой на 50 ° C. хранить при комнатной температуре в культуре Худ. Подготовить решение фиксации: параформальдегида 3% + 2% сахарозы в фосфат амортизированное saline (PBS). 1000 мл стеклянной бутылке, добавить 700 мл PBS и параформальдегида 30 г. Предупреждение: Параформальдегида коррозионные, носите соответствующие перчатки. Растворяют параформальдегида полностью путем нагрева до 80 ° C, с помощью микроволновой. Предупреждение: Параформальдегида газы являются токсичными, носить маску. Оставить на ночь при комнатной температуре. Добавить 20 г сахарозы. Добавить PBS сделать общий объем 1 л Алиготе в 50 мл трубки. Фиксация раствор может храниться на 3-х лет при-20 ° C или на 3 месяца на 4 ° C. 2. Подготовка клеточной культуры Примечание: эти процедуры должны выполняться в культуре Худ. Клетки человека остеосаркома U2OS культуры и проход для поддержания логарифмического роста 5. Примечание: Другие типы клеток может использоваться после определения оптимального облучения доза. Удаление скальпелем с бумажным полотенцем, смоченным 70% этиловом спирте. С помощью скальпеля, поместите крышку выскальзования на 35 мм ячейку культуры блюдо (далее просто называют " блюдо "). Примечание: Количество скользит крышка в одном блюде может быть увеличена согласно экспериментальный дизайн (см. обсуждение). Добавить 1 мл культуры СМИ: DMEM дополнена 10% плода бычьим сывороточным. Примечание: Другие средства массовой информации могут использоваться в зависимости от типа выбранной ячейки. Щипцы очистки с помощью бумажных полотенец смоченным 70% этиловом спирте. С помощью щипцов, аккуратно прижмите центр крышки выскальзования. Аспирационная культуры СМИ от блюдо полностью, сохраняя при этом провести на крышку выскальзования. ​ Примечание: этот шаг способствует иммобилизации крышку выскальзования блюдо. Отсоединить адэрентных культивируемых клеток с использованием трипсина 5. Аспирационная Культура СМИ от блюдо. Добавьте 1 mL PBS и осторожно встряхнуть блюдо. Аспирационная PBS от блюдо. Добавить 1 мл трипсина [0.25w/v% ЭДТА трипсина 1mmol/Л] блюдо. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C в атмосфере, содержащей 5% CO 2. Добавить 9 мл культуры средств массовой информации к блюду. С помощью 1000 мкл микропипеткой, подготовить подвеска одноклеточных. Количество клеток 5. В 1,5 мл трубку, добавить 0,9 мл суспензии клеток и 0,1 мл 0,4% раствор Трипановый синий. Применять 10 мкл к Горяева. Рассмотреть количество незапятнанное (то есть, жить) клетки под микроскопом Перевернутый фазы. В 15 мл трубку, подготовить 3 мл суспензии клеток в культуре средств массовой информации на плотность 0,5 x 10 5 клеток/мл. Примечание: Ячейка, плотность может быть изменен в соответствии с экспериментальной нужно (см. обсуждение). Нежно добавить 2 мл суспензии клеток к блюду. Инкубировать на ночь при 37 ° C в атмосфере, содержащей 5% CO 2. 3. Облучение ОСТОРОЖНОСТЬЮ: обрабатывать рентгеновский облучатель тщательно, по словам производителя ' s инструкции. Изучить клетки под микроскопом Перевернутый фазы. Убедитесь, что клетки крепятся крышки выскальзования и живой. Облучить блюдо с 6 рентген гр (1,4 гр/мин, 300 KVP, 20 мА). Инкубировать за 72 ч при 37 ° C в атмосфере, содержащей 5% CO 2. Примечание: Время инкубации могут быть изменены согласно экспериментальный дизайн (см. обсуждение). 4. Фиксация аспирационная Культура СМИ от блюдо. Использование ножницами, вырезать кончик 1000 мкл микропипеткой наконечник 5 мм от конца. Примечание: Вырезать кончик помогает плавно применять решение фиксации. С помощью среза кончика, добавить 1 мл раствора фиксации (подготовленных на шаге 1.2) блюдо из боковой стенки посуды. Примечание: Этот шаг является срочным и поэтому должны выполняться без изменения микропипеткой советы при обработке нескольких образцов. Применение раствора фиксации непосредственно к нижней части блюдо может повредить клетки. Место в квадратных культуры блюдо блюдо. Встряхнуть квадратных культуры блюдо осторожно, чтобы равномерно распределить фиксации решение через крышку выскальзования. Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре. Аспирационная фиксации решение от блюдо. Добавить 2 мл PBS на блюдо из боковой стенки посуды. Примечание: Применение PBS непосредственно к нижней части блюдо может повредить клетки. Аспирационная PBS от блюдо. Повторите шаги 4.7 и 4.8 дважды . Примечание: Блюдо можно хранить в течение 1 недели при температуре 4 ° C с скользит крышка, купались в 2 мл PBS. 5. DAPI окрашивание на слайд стакан, применить 5 мкл 1 мкг/мл DAPI пятнать реагент. Примечание: Окрашивание реактива DAPI стабильным за 6 месяцев при хранении защищены от света на уровне или ниже -20 ° с. С помощью скальпеля, удалите крышку выскальзования из блюдо. Снимать избыток PBS на крышку выскальзования, касаясь края крышки выскальзования с бумажным полотенцем. Монтировать крышку выскальзования вверх вниз на падение DAPI окрашивание реактива на стекле слайд так, что клетки подвергаются DAPI окрашивание реактива. Примечание: Этот шаг является срочным. Сушка DAPI пятнать реагент может привести к неоптимальной пятнать. Образцы могут быть сохранены на 1 год -20 ° с. 6. Видеосъемка изучения образца на флуоресцентным микроскопом. Ядер визуализируются с помощью фильтра DAPI. Примечание: Либо 20 X 60 X нефти объектив может использоваться или, по мнению исследователя ' интерес. При использовании 60 X объектив масла, добавьте одну каплю масла на крышку выскальзования. Будьте осторожны, что образцы не касайтесь объектива; в противном случае, может быть поврежден объектив. Получить изображения с помощью CCD камеры и программное обеспечение получения цифровых изображений с следующие параметры и параметры ядра: DAPI фильтр, однослойные изображения, получить 1 X, и автоматической экспозиции. Отделка Видеосъемка: протрите 20 X объектив с бумажным полотенцем, смоченным объектив чище. Протрите 60 X нефти объектив с бумажным полотенцем, смоченным хлороформе. 7. Оценка колониеобразования режим смерти клетки в случайно выбранных изображений, подсчитать количество ядер, которые удовлетворяют критериям для apoptosis, митотической катастрофе и клеточного старения до тех пор, пока общее количество подсчитанных ядрами достигает 300. Проводить этот шаг в трех экземплярах для каждой экспериментальной установки. Критерии апоптоз: наличие apoptotic тела (то есть, конденсированной и фрагментации ядер) 6 , 7. Критерии для митотической катастрофе: наличие ядер, показаны два или более отдельных лепестков или micronuclEI 8 , 9 , 10. Критерии для клеточного старения: наличие очагов старение связанные гетерохроматиновые (SAHF) (т.е., ядерной ДНК, содержащие 30-50 яркие, плотные очаги) 2 ,- 11.

Representative Results

Как, например клетки человека остеосаркома U2OS были относиться с 6 рентген гр, инкубировали в течение 72 ч и подвергается DAPI пятнать пробирного согласно протоколу. На рисунке 1 показана увеличенного изображения для типичных ядерных морфологии, связанные с apoptosis, митотической катастрофе и клеточного старения, полученные с помощью объектива масла 60 ×. Обратитесь к 7.1.1-7.1.3 шаги для характерных морфологии для каждого режима колониеобразования клеточной смерти. Рисунок 2 показывает обзор изображений ядра, полученные с помощью 20 X объектив. Облучение с 6 Gy рентген индуцированной митотической катастрофе часто, апоптоз менее часто и редко клеточного старения. Таким образом изучение на поле низкой увеличение позволяет задержать с первого взгляда общую картину профиля смерти клетки колониеобразования в данных экспериментальных условиях. На рисунке 3 показано графическое представление количественных данных. Рисунок 1: масштаб изображения DAPI-окрашенных ядер, показаны типичные морфологии апоптоза, митотической катастрофе и клеточного старения. U2OS клетки были облучены с 6 рентген гр. После 72 ч клетки были исправлены и витражи с DAPI. Ядерные изображения были приобретены с помощью 60 X объектив нефти. Шкалы бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: обзор изображений DAPI-окрашенных ядер клеток лечение рентгеном. U2OS клетки были облученного с 6 Gy рентген или макет облученных. После 72 ч клетки были исправлены и витражи с DAPI. Образы ядра были приобретены с использованием 20 X объектив. Круги, апоптоза; стрелки, митотической катастрофе. Шкалы бар = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: количественных данных для apoptosis, митотической катастрофе и клеточного старения, индуцированной в клетках, обработанных с рентгеновским излучением. U2OS клетки были облученного с 6 Gy рентген или макет облученных. После 72 ч клетки были исправлены и витражи с DAPI. Образы ядра были приобретены с использованием 20 X объектив. От случайных полей были оценены в общей сложности 300 ядер для apoptosis (Ap), митотической катастрофе (MC) и клеточного старения (Sns). Эти оценки были проведены в трех экземплярах. Показаны средние значения, и погрешностей указывают стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Ниже приводятся важнейшие шаги в рамках протокола. Во-первых клетки следует выращивать на культуры блюдо как монослоя потому что морфологической оценки DAPI-окрашенных ядер трудно для многослойных клеток. С этой целью, в шаге 2.9 рекомендуется тщательное передачи культуры блюдо в инкубаторе; сотрясение культуры блюдо генерирует вихрем подвесной клетки, что приводит к концентрации клеток в центре культуры блюдо. Кроме того следует избегать overconfluence, ведущих к многослойных клетки. С этой целью, в шаге 2.7 количество клеток посеян на культуры блюдо может быть изменен на основании населения, удвоение время и интервал между облучения и фиксации. Рекомендуется слияния приблизительно 80 в момент фиксации. Во-вторых скорость имеет важное значение в фиксации и DAPI окрашивание (то есть, шаги 4 и 5). Между образец непоследовательность в отношении времени, необходимого для этих шагов может привести к неоднородности в DAPI интенсивности сигнала в ядрах, которые будет затушевывать морфологической оценки.

В шаге 2.2 можно увеличить количество скользит крышка в одной культуры блюдо; максимум четыре скользит крышка может быть помещен в 35 мм блюдо, и число можно увеличить с помощью больших блюда. Размещение нескольких скользит крышка в каждой культуры блюдо позволяет эффективного функционирования время курса оценки для данного обращения (т.е., Обложка, который скользит могут быть собраны из культуры блюдо по одному в нескольких точках времени интерес).

В шаге 3.2 доза облучения может быть изменен согласно интерес исследователей. Применение последовательного доза в несколько клеточных линий позволяет сравнения чувствительности для каждого режима колониеобразования клеточной смерти среди клеточных линий. С другой стороны использование iso колониеобразования выживания доз для каждой ячейки строки позволяет Сравнение профилей смерти клетки колониеобразования среди клеточных линий. Iso колониеобразования выживания доза может определяться колониеобразования выживания пробирного12. D10 , доза, которая обеспечивает выживание колониеобразования 10%, значение общей конечной точки для iso колониеобразования выживания дозы.

В шаге 3.3 время от излучения до фиксации могут быть изменены согласно интерес исследователей; Это важно, потому что пиковое время для ИК индуцированного апоптоза, митотической катастрофе и сотовой старение зависит от линии клеток и лечения. В этой статье мы использовали 72 ч после облучения, как момент времени, который будет наиболее полезным для первоначальной проверки колониеобразования клеток смерти профили, основанные на нескольких исследований нашей группой и другие описанные следующим1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) рентген-индуцированной апоптоз в клетках, создана из солидных опухолей основном происходит через несколько дней после облучения. (ii) X-рентген-индуцированной митотической катастрофе в раковых клетках происходит наиболее видное место на второй или третий митоз после освобождения из-под ареста временного цикла клетки под воздействием облучения. Выпуск обычно происходит примерно 24 часа после облучения, а затем путем неоднократных митозов интервалами около 24 ч. (iii) X-Рэй индуцированной сотовой старение становится очевидным после интервала зависит от линии клеток в вопрос: через 2 дня после облучение для некоторых ранних случаев и через 7 дней после облучения для большинства клеточных линий. После получения общую картину колониеобразования ячейки смерти профили от первоначальных скрининг, время экспериментов курс обеспечит более подробное разъяснение пиковое время для каждого режима колониеобразования клеточной смерти в конкретной ячейке строки или состояние 4интерес.

Следует отметить, что DAPI окрашивание пробирного и колониеобразования assay выживаемости, метод золотой стандарт для оценки чувствительности излучения, не являются взаимозаменяемыми. Апоптоз и митотической катастрофе только в течение часа. Таким образом DAPI пятнать assay для точки заданного времени обнаруживает апоптоз и митотической катастрофе, которая происходит на этапе оценки. С другой стороны результаты выживания колониеобразования пробирного в данный момент точки включают общее количество апоптоза и митотической катастрофе, которые имели место во время инкубационного периода, обычно 10-14 дней после облучения. Отличается от апоптоза и митотической катастрофе, стареющей клетки остаются на культуры блюдо; они накапливаются постепенно с течением времени после облучения. Таким образом результаты обоих DAPI окрашивание пробирного и assay выживаемости колониеобразования отражают общее количество старения, которые произошли во время инкубационного периода. Важно отметить, что доля апоптоза, митотической катастрофе и старения, вызванного облучением широко варьируется в зависимости от клеток линии и облучения доза. Вместе взятые, теоретически, результаты одного анализа нельзя быть переведены непосредственно на те из других assay.

Пятнать пробирного DAPI имеет несколько ограничений. Во-первых она остается спорным ли митотической катастрофе — это собственный режим смерти клетки. В области радиационной биологии митотической катастрофе считается основной режим IR-индуцированной клеточной смерти, которая отличается от других механизмов колониеобразования клеток смерти1. С другой стороны другие утверждают, что митотической катастрофе это не собственный режим смерти клетки, а скорее процесс, предшествующий смерти клетки, включая некроз и апоптоз13,14. Таким образом в определенной степени могут перекрываться апоптоз и митотической катастрофе. Во-вторых, предыдущие исследования показывают, что сотовой старение может произойти в отсутствие SAHF в некоторых клеточных линий и лечения параметры2. В настоящее время, другие анализы, специально предназначенные для каждой ячейки колониеобразования смерти режим должен использоваться для повышения надежности выводов данного эксперимента. В-третьих DAPI пятнать пробирного нельзя оценить режимы колониеобразования клеточной смерти помимо апоптоза, митотической катастрофе и клеточного старения (например, некроз и autophagy). В-четвертых не выяснен утилита DAPI пятнать пробирного как предсказатель реакции опухоли на лучевой терапии в клинике. С этой точки зрения пробирного колониеобразования выживания, которая оценивает общее количество колониеобразования клеточной смерти, превосходит DAPI пятнать пробирного потому, что была установлена корреляция между SF2, сохранившихся часть клеток облучали с 2 гр Рентген и опухоль ответ радиотерапии15. Тем не менее стоит отметить, что колониеобразования assay выживаемости не используется широко в клинике, главным образом из-за требование высокой степени компетентности и длительного периода времени (например, 14 дней) для сбора данных. Для сравнения процедура для окрашивания пробирного DAPI проще и занимает значительно меньше времени, примерно 3-4 дня, для получения результатов. Утилита DAPI окрашиванияпробирного как предсказатель реакции опухоли на лучевой терапии будет испытываться в клинике в ближайшем будущем.

В резюме DAPI пятнать пробирного является экономически одношаговый пробирного одновременно оценить три основных режима ИК индуцированной колониеобразования клеточной смерти. Этот подход позволяет легко экран для режимов колониеобразования клеточной смерти для различных клеточных линий, параметры лечения и моменты времени, с целью выяснения механизмов гибели клеток в клетки-мишени и условий, представляющих интерес.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим г-жа Акико Сибата для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана дотаций от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии Японии для программ для ведущих выпускник школы, выращивание глобальных лидеров в тяжелых ионов клинической медицины и техники.

Materials

cover slip Matsunami C013001
paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-1KG
sucrose Sigma-Aldrich 84097-250G
phosphate-buffered saline Cosmo Bio 16232000
scalpel Kai Medical No.20, 520-A
35 mm cell culture dish Falcon 353001
trypsin Wako 201-16945
inverted phase microscope Shimazu 114-909
X-ray irradiator Faxitron Bioptics Faxitron RX-650
square culture dish Corning 431110
slide glass Matsunami Pro-11
DAPI staining reagent Cell Signaling 8961S
fluorescence microscope Nikon ECLIPSE Ni
fluorescence microscope DAPI filter Nikon U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410
fluorescence microscope lens (20×) Nikon Plan Apo λ 20X/0.75
fluorescence microscope lens (60×, oil) Nikon Plan Apo λ 60X/1.40 oil
oil Olympus N5218600
CCD camera Nikon DS-Qi2
digital image acquisition software Nikon NIS-Elements Document
lens cleaner Olympus OT0552
chloroform Wako 035-02616

References

  1. Wouters, B. G., Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. , 27-40 (2009).
  2. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
  3. Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588 (2017).
  4. Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121 (2014).
  5. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
  6. Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
  7. Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , (2012).
  8. Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
  9. Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
  10. Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
  11. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
  12. Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
  13. Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
  14. Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950 (2016).
  15. Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).

Play Video

Cite This Article
Kobayashi, D., Shibata, A., Oike, T., Nakano, T. One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (128), e56338, doi:10.3791/56338 (2017).

View Video