Forskning på ioniserende stråling (IR)-induceret clonogenic celledød er vigtigt for at forstå virkningerne af IR på Maligne tumorer og normale væv. Her, vi beskriver en et-trins analyse til vurdering af de vigtigste former for IR-induceret clonogenic celledød baseret på morfologi af 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI)-farves kerner visualiseret ved Fluorescens mikroskopi.
Forskning på ioniserende stråling (IR)-induceret clonogenic celledød er vigtigt for at forstå effekten af IR på Maligne tumorer og normale væv. Her beskriver vi en hurtig og omkostningseffektiv one-step assay for samtidig vurdere de store transportformer clonogenic celledød induceret af IR, dvs, apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære ældning. I denne metode, er celler dyrkes på et cover slip bestråles med røntgenstråler og farves med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI). Ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, er apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne identificeret baseret på de karakteristiske morfologier af DAPI-farvede kerner. Apoptose er bestemt af tilstedeværelsen af apoptotiske organer (dvs., kondenseret og fragmenterede kerner). Mitotiske katastrofe er bestemt af tilstedeværelsen af kerner, der udviser to eller flere adskilte kamre og mikronukleus. Cellulære gulne bestemmes ved tilstedeværelsen af gulne-associerede heterochromatic foci (dvs., nukleare DNA med 30-50 lyse, tætte foci). Denne tilgang gør det muligt for eksperimentatoren at nemt skærm for clonogenic celle død tilstande ved hjælp af forskellige cellelinjer, indstillinger for behandling og tidspunkter, med formålet at belyse mekanismerne for celledød i target-cellerne og betingelser af interesse.
Ioniserende stråling (IR) inducerer flere former for clonogenic celledød. Forskning på IR-induceret clonogenic celledød er vigtig for at forstå IR toksicitet til normale væv, samt til at udvikle metoder til at øge behandling effekten af kræft strålebehandling. Apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære ældning er de store transportformer clonogenic celledød induceret af IR1. Apoptose er en reguleret tilstand af celledød, der er initieret af DNA skade1. Mitotiske katastrofe er celledød, der opstår på grund af afvigende mitosen skyldes unrepaired DNA dobbelt-strenget pauser1. Cellulære gulne er defineret som en tilstand af irreversibel celle vækst anholdelse2; Bemærk at cellulære gulne er ikke celledød per se, men det er en tilstand af clonogenic celledød fordi det afskaffer clonogenic overlevelse af cellen senescent.
Forskellige cellebaserede assays er udviklet individuelt vurdere apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære ældning. Apoptose kan vurderes ved terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-ende mærkning (TUNEL) farvning, annexin V farvning, DNA fragmentering assays og sub-G1 cellecyklus fase bestemmelse af flow flowcytometri1. Mitotiske katastrofe kan vurderes ved immunfluorescens farvning for mitotiske markører, herunder MPM2, TUNEL farvning og elektronmikroskopi1. Cellulære gulne kan vurderes af gulne-associerede β-galactosidase (SA-β-Gal) farvning, vækst-anholdelse assays og elektronmikroskopi1. Vigtigere er, den dominerende transportform clonogenic celledød adskiller sig blandt cellelinjer og behandling indstillinger3,4. Derfor, for at belyse den overordnede profil af clonogenic celledød for en given eksperimentelle indstilling, flere assays dækker alle disse tilstande af død skal føres sammen, hvilket er omkostningerne- og arbejdskrævende.
I denne artikel vil beskrive vi en hurtig og omkostningseffektiv one-step assay samtidig vurdere apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne induceret af IR3,4. I denne metode, er celler dyrkes på et cover slip bestråles med røntgenstråler og farves med 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochlorid (DAPI). Ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, identificeres apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne hver baseret på de respektive karakteristiske morfologier af DAPI-farvede kerner. Denne tilgang vil være nyttigt for programmer, herunder screening for clonogenic celle død profiler i forskellige cellelinier, behandling indstillinger og tidspunkter, med mål at undersøge mekanismerne af celledød i target-cellerne og betingelserne for interesse.
De kritiske trin i protokollen er som følger. Først, skal celler dyrkes på kultur parabol som en éncellelag fordi en morfologisk bedømmelse af DAPI-farvede kerner er vanskeligt for flere lag celler. Til dette formål, taktfast 2.9, anbefales omhyggelig overførsel af kultur parabol til en inkubator; ryste af kultur parabol genererer en hvirvel af suspenderede celler, der fører til koncentrationen af celler i midten af kultur parabol. Derudover bør overconfluence fører til flere lag celler undgås. Herpå, taktfast 2.7, kan antallet af celler seedede på kultur parabol ændres baseret på befolkningens fordobling tid og intervallet mellem bestråling og fiksering. En sammenløb af omkring 80 på tidspunktet for fiksering anbefales. Andet, hastighed er vigtig i optagelsen og DAPI farvning (dvs., trin 4 og 5). Inter prøve uoverensstemmelse med hensyn til den tid, det tager for disse trin kan føre til forskelligartethed i DAPI signal intensitet i kerner, hvilket ville forvanske den morfologiske vurdering.
Taktfast 2.2 kan antallet af cover smutter i en enkelt kultur parabol øges; et maksimum på fire dæksel glider kan placeres i en 35 mm parabol, og antallet kan blive øget yderligere ved hjælp af større retter. Placere flere cover underkjoler i hver kultur parabol gør det muligt for den effektive drift af tid kursus vurdering af en given behandling (dvs., dækslet til følgesedler kan indsamles fra en kultur parabol én efter én på flere tidspunkter af interesse).
Taktfast 3.2 kan bestråling dosis ændres ifølge forskernes interesse. Anvendelse af en ensartet dosis på flere cellelinjer muliggør sammenligning af følsomhed over for hver tilstand af clonogenic celledød blandt cellelinjer. På den anden side de iso-clonogenic overlevelse doser for hver cellelinje giver mulighed for sammenligning af clonogenic celle død profiler blandt cellelinjer. Iso-clonogenic overlevelse dosis kan bestemmes ved clonogenic overlevelse assay12. D10 værdi, den dosis, der giver 10% clonogenic overlevelse, er en fælles slutpunkt til iso-clonogenic overlevelse dosis.
Taktfast 3.3 kan tiden fra bestråling til fiksation ændres ifølge forskernes interesse; Dette er vigtigt fordi spidsbelastningen for IR-induceret apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne varierer efter cellelinie og behandling. I denne artikel, vi brugt 72 h efter bestråling som det tidspunkt, der ville være mest nyttig for den indledende screening af clonogenic celle død profiler, baseret på flere undersøgelser af vores gruppe og andre beskrevet som følger1,2, 3 , 4 , 8 , 9: (i) X-stråle-induceret apoptose i celler etableret fra solide tumorer oftest opstår et par dage efter bestråling. (ii) X-stråle-induceret mitotiske katastrofe i kræftceller opstår mest fremtrædende på den anden eller tredje mitosen efter overgang fra midlertidig celle-cyklus anholdelse induceres ved bestråling. Udgivelsen sker normalt ca 24 timer efter bestråling, efterfulgt af gentagne mitoses i intervaller på ca 24 h. (iii) X-stråle-induceret cellulære gulne bliver tydeligt efter et interval afhængig af den pågældende cellelinie: 2 dage efter bestråling for nogle tidlig tilfælde, og 7 dage efter bestråling for de fleste cellelinjer. Efter at opnå et overordnet billede af cellen clonogenic død profiler fra den indledende screening, tid kursus eksperimenter vil give en mere detaljeret forklaring af spidsbelastningen for hver tilstand af clonogenic celledød i specifikke cellelinie og/eller tilstand renter4.
Det skal bemærkes, at DAPI farvning assay og clonogenic overlevelse assay, en guld-standard metode for stråling følsomhed vurdering, ikke der udskiftelige. Apoptose og mitotiske katastrofe kun vare timer. Således registrerer DAPI farvning assay for en given tidspunkt apoptose og mitotiske katastrofe, der opstår for tidspunkt for vurderingen. På den anden side assay resultaterne af clonogenic overlevelse på et givet tidspunkt punkt omfatter det samlede beløb af apoptose og mitotiske katastrofe, der var sket under inkubationstiden for typisk 10-14 dage efter bestråling. Forskellig fra apoptose og mitotiske katastrofe, senescent celler forbliver på kultur fadet; de ophobes gradvist over tid efter bestråling. Derfor, resultaterne af begge DAPI farvning assay og clonogenic overlevelse analyse afspejler det samlede beløb for ældning, som opstod under inkubationstiden. Vigtigere, andelen af apoptose, mitotiske katastrofe og gulne induceres ved bestråling varierer meget efter celle linje og bestråling dosis. Tilsammen, teoretisk, resultaterne af en analyse ikke kan oversættes direkte til dem af andre analysen.
DAPI farvning assay har nogle begrænsninger. Først, det er fortsat kontroversielt, om mitotiske katastrofe er en særskilt transportform celledød. Inden for stråling biologi anses mitotiske katastrofe en større tilstand af IR-induceret celledød, der adskiller sig fra andre mekanismer clonogenic celle død1. På den anden side hævder andre at mitotiske katastrofe ikke er en særskilt transportform celledød, men snarere en proces, der går forud for celledød herunder apoptose og nekrose13,14. Således apoptose og mitotiske katastrofe kan overlappe hinanden til en vis grad. Andet, tidligere undersøgelser tyder på, at cellulære gulne kan forekomme i fravær af SAHF i nogle cellelinjer og behandling indstillinger2. På nuværende, andre assays specialdesignet til hver clonogenic celle bør død tilstand anvendes til at øge robustheden af konklusionerne i en given eksperiment. For det tredje kan ikke DAPI farvning assay vurdere tilstande af clonogenic celledød end apoptose, mitotiske katastrofe og cellulære gulne (fx, nekrose og autophagy). For det fjerde har nytte af DAPI farvning assay som en prædiktor for tumor respons på strålebehandling ikke blevet belyst i klinikken. Fra dette synspunkt er clonogenic overlevelse analyse, som vurderer den samlede clonogenic celledød, overlegen i forhold til DAPI farvning assay, fordi en sammenhæng er blevet etableret mellem SF2, de overlevende brøkdel af celler bestråles med 2 Gy X-stråler, og strålebehandling15tumor svaret. Det er dog værd at bemærke, at clonogenic overlevelse analyse ikke udnyttes bredt i klinikken, hovedsagelig på grund af kravet om en høj grad af ekspertise og en lang periode (dvs., 14 dage) for dataopsamling. Til sammenligning, proceduren for DAPI farvning assay er enklere og tager betydeligt kortere tid, ca. 3-4 dage, til at skabe resultater. Nytten af DAPI farvninganalysen som en prædiktor for tumor respons på strålebehandling vil blive testet i klinikken i den nærmeste fremtid.
Sammenfattende er DAPI farvning assay en omkostningseffektiv one-step assay samtidig vurdere de tre store tilstande af IR-induceret clonogenic celledød. Denne tilgang gør det muligt at nemt skærm for tilstande af clonogenic celledød for forskellige cellelinjer, indstillinger for behandling og tidspunkter, med formålet at belyse mekanismerne for celledød i target-cellerne og betingelser af interesse.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker fru Akiko Shibata for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan for programmer for førende kandidat skoler, dyrke globale ledere i tunge Ion Therapeutics og teknik.
cover slip | Matsunami | C013001 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-250G | |
phosphate-buffered saline | Cosmo Bio | 16232000 | |
scalpel | Kai Medical | No.20, 520-A | |
35 mm cell culture dish | Falcon | 353001 | |
trypsin | Wako | 201-16945 | |
inverted phase microscope | Shimazu | 114-909 | |
X-ray irradiator | Faxitron Bioptics | Faxitron RX-650 | |
square culture dish | Corning | 431110 | |
slide glass | Matsunami | Pro-11 | |
DAPI staining reagent | Cell Signaling | 8961S | |
fluorescence microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
fluorescence microscope DAPI filter | Nikon | U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410 | |
fluorescence microscope lens (20×) | Nikon | Plan Apo λ 20X/0.75 | |
fluorescence microscope lens (60×, oil) | Nikon | Plan Apo λ 60X/1.40 oil | |
oil | Olympus | N5218600 | |
CCD camera | Nikon | DS-Qi2 | |
digital image acquisition software | Nikon | NIS-Elements Document | |
lens cleaner | Olympus | OT0552 | |
chloroform | Wako | 035-02616 |