Summary

Uso de Immunolabeling para analisar os microtúbulos estáveis, dinâmicos e emergentes no embrião Zebrafish

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

Immunolabeling métodos para analisar populações distintas de microtúbulos no cérebro em desenvolvimento zebrafish são descritos aqui, que são amplamente aplicáveis a outros tecidos. O primeiro protocolo descreve um método otimizado para immunolabeling estável e dinâmica de microtúbulos. O segundo protocolo fornece um método para a imagem e quantificar microtúbulos nascentes especificamente.

Abstract

Microtúbulos (MTs) são estruturas dinâmicas e frágeis que são desafiadores para imagem na vivo, particularmente em embriões de vertebrados. Immunolabeling métodos são descritos aqui para analisar populações distintas de MTs em tubo neural em desenvolvimento do embrião do zebrafish. Enquanto o foco estiver em tecido neural, esta metodologia é amplamente aplicável para outros tecidos. Os procedimentos são otimizados para cedo aos embriões de meados-somitogenesis-estágio (1 somite para 12 somitas), no entanto podem ser adaptadas a uma gama de outras fases com relativamente pequenos ajustes. O primeiro protocolo fornece um método para avaliar a distribuição espacial da MTs estáveis e dinâmicos e realizar uma análise quantitativa dessas populações com software de processamento de imagem. Essa abordagem complementa as ferramentas existentes para imagem microtubule dinâmica e distribuição em tempo real, usando linhas transgénicas ou expressão transiente de construções etiquetadas. Com efeito, tais ferramentas são muito úteis, porém eles não facilmente distinguir entre MTs dinâmicos e estáveis. A capacidade de imagem e analisar essas populações distintas do microtubule tem implicações importantes para os mecanismos de compreensão subjacente a polarização celular e morfogênese. O segundo protocolo descreve uma técnica para analisar especificamente o nascentes MTs. Isso é realizado através da captura as propriedades de crescimento de novo do MTs ao longo do tempo, seguindo microtubule despolimerização com a drogas nocodazole e um período de recuperação após o fracasso de drogas. Esta técnica ainda não tiver sido aplicada ao estudo da MTs em embriões de peixe-zebra, mas é um ensaio valioso para investigar a função no vivo das proteínas implicado na montagem de microtúbulos.

Introduction

Microtúbulos (MTs) são polímeros de α – e β-tubulina que reúne numa protofilamentos lineares, vários dos quais se combinam para formar um tubo oco1,2. MTs são estruturas polarizadas, com rápido crescimento além de extremidades e crescimento lento menos extremidades ancorados na centrossoma ou outros microtubule-organização centro (MTOC)3. De novo Formação de MT é iniciada pela nucleação no complexo anel γ-tubulina (γ-TURC), que fornece um modelo para montagem de MT4. Em qualquer determinada célula, duas populações de MTs distinguem-se a curva sobre a taxas diferentes. MTs dinâmicos explorar seu ambiente celular alternando entre fases de crescimento e retração em um processo conhecido como instabilidade dinâmica5. Ao contrário de dinâmicas MTs, MTs estáveis são não-crescimento e tem uma meia-vida mais longa que a dinâmica MTs6.

Décadas de pesquisa em biologia celular tem fornecido um sofisticado conjunto de ferramentas para estudar a função e estrutura de MT e resultou em um grande corpo de conhecimento sobre esses elementos do citoesqueleto. Por exemplo, MTs desempenham um papel central no estabelecimento e na manutenção da polaridade da célula, que é atribuível não só a sua polaridade intrínseca, mas também para a distribuição diferencial subcellular de estábulo versus dinâmico MTs7, 8. em contraste, muito menos é compreendido sobre arquitetura de MT e função em ambientes (3D) tridimensionais mais complexos, tais como os embriões vertebrados, em parte devido ao desafio de citoesqueleto MT em alta resolução de imagem. Apesar desta limitação, a geração recente de transgênico GFP-expressando as linhas esse rótulo MTs ou expressão transiente de marcadores de MT marcados fluorescentemente aumentou nossa compreensão das mudanças dinâmicas que se submetem a MTs e seus celulares e papel do desenvolvimento no embrião zebrafish. Toda a rede de MT pode ser fotografada em linhas transgénicas na qual tubulina ou é diretamente rotulados polímeros9 ou tubulina indiretamente são etiquetados usando proteínas associadas MT Doublecortin-como-quinase (Dclk) ou Ensconsin (EMTB)10, 11. Outras linhas (e construções) foram geradas que permitem avaliação de polaridade intrínseca de MT por rotulagem especificamente MT além termina ou centrossoma ancorada menos termina11,12,13, 14. o poder dessas ferramentas encontra-se na capacidade de estudar a dinâmica de MT em ao vivo, organismos em desenvolvimento. Tais estudos têm revelado, por exemplo, a distribuição espacial e dinâmica de MTs em populações de células específicas, a orientação de mitótica fusos em tecidos submetidos a morfogênese (um indicador do plano de divisão celular), a polaridade do polímero MT no que se refere aos processos, tais como alongamento celular e migração e a taxa de crescimento de MT determinada pelo cometa velocidade9,13,15. A limitação dessas ferramentas é que eles não prontamente qualquer discriminação entre as populações de MT estáveis e dinâmicas.

Desenho da literatura biologia celular rico, immunolabeling métodos de imagem estáveis e dinâmicos MTs no zebrafish embrião são descritos aqui, que são complementares para o uso de linhas transgénicas. O uso generalizado de tais métodos immunolabeling no zebrafish tem sido um pouco dificultado pela dificuldade em preservar a integridade de MT durante o procedimento de fixação. 1 protocolo descreve um método otimizado para immunolabeling total, dinâmico, e MTs estáveis em secções do rombencéfalo zebrafish desenvolvimento transversais. Além disso, um método simples usando comercialmente software disponível é descrita para quantificar estas populações de MT. MTs estáveis são distintos dos MTs dinâmicos com base em várias modificações borne-translational do α-tubulina, tais como a acetilação e detyrosination, que se acumulam na MTs estáveis ao longo do tempo16,17. No embrião zebrafish, acetilação ocorre em ciliares e axonal MTs mas não em interfase estável MTs18, limitando a utilidade deste marcador a um subconjunto de MTs estabilizados. Em contraste, detyrosination parece ocorrer em todos os MTs estáveis em zebrafish embrião18. Esta modificação pós-traducional expõe o ácido glutâmico carboxy-terminal de α-tubulina (detyrosinated tubulina)18 e pode ser detectada usando anti-Glu-tubulina19. Embora detyrosination ocorre preferencialmente na MTs estáveis, evidência experimental indica que esta modificação pós-traducional é um resultado de, ao invés de uma causa de, estabilidade de MT16. Distingue-se a população MT recíproca, composta por MTs dinâmicos, usando um anticorpo, anti-Tyr-tubulina, que reconhece especificamente a forma tyrosinated de α-tubulina19. Após immunolabeling com estes marcadores e imagem latente confocal, análise quantitativa de MTs (comprimento, número e abundância relativa) pode ser realizada em regiões definidas do tubo neural em desenvolvimento. Aqui, é fornecido um método simplificado para realizar esta análise, utilizando o software de processamento de imagem em 3D. Esse método pode ser aplicado para responder a perguntas sobre morfogênese e o estabelecimento ou a maturação de células polaridade20. Com efeito, a elaboração de matrizes polarizadas de estáveis MTs acompanha muitos eventos do desenvolvimento, incluindo fotorreceptoras morfogênese21, epitelização das células no desenvolvimento do tubo neural18 e axônio formação8.

2 protocolo descreve uma adaptação na vivo de um ensaio de biologia de pilha para analisar MTs durante sua montagem fase (nucleação/fixação e crescimento)22,23. MTs nascentes são nucleated na centrossoma e posteriormente ancoradas apêndices subdistal da mãe centriole23. É descrito um método para analisar a nascente MT rebrota após despolimerização. Este protocolo fornece detalhes sobre o tratamento de nocodazole para depolymerize MTs, o processo de esmaecimento de droga e o período de recuperação pós-tratamento. Re-crescimento de MT é monitorado em intervalos regularesesmaecimento de post s por immunolabeling com marcadores para MTs totais (anti β-tubulina) ao lado de marcadores para a centrossoma (anti γ-tubulina) e núcleo (4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), de acordo com os procedimentos gerais descritos no protocolo 1. A etapa de despolimerização MT do presente protocolo é essencial, como permite a avaliação do crescimento de MT de novo , em vez de extensão de MTs preexistentes. Esta técnica é, portanto, distinta de outros procedimentos publicados para medir as taxas de crescimento de MT (na ausência de despolimerização) usando um marcador de ponta mais como fim proteína 3 fundido a proteína verde fluorescente (EB3-GFP), conforme mostrado no Tran et al., 201211. Além disso, este ensaio é particularmente útil para a análise de embriões com defeito na montagem de novo MT, tais como os mutantes NEDD1 relatados anteriormente, em que o recrutamento de γ-tubulina para a centrossoma é prejudicado, resultando em incompleta formação do tubo neural e defeitos neuronal24.

Protocol

declaração de ética: os procedimentos descritos abaixo siga a Universidade das orientações de cuidados com animais de Maryland, Baltimore County. 1. análise de estável e dinâmico MTs usando Immunolabeling (protocolo 1) dechorionation Manual de embriões antes da fixação obter recentemente gerou embriões derramando água em excesso do sistema e Então, coletar embriões restantes em uma placa de Petri de plástico (consulte a Tabela de mat…

Representative Results

Análise de MTs estáveis e dinâmicos usando immunolabelingNo protocolo n º 1, a distribuição das subpopulações de MT durante o início (quilha neural) e os estágios finais (haste neural) do desenvolvimento do tubo neural são revelados, usando Glu-tubulina e Tyr-tubulina como marcadores para MTs estáveis e dinâmicos, respectivamente. MTs dinâmicas predominam o rombencéfalo na fase neural da quilha (4-5 somitas) (Figura…

Discussion

Atualmente existem muitos métodos de imagem dinâmica de MT no início do desenvolvimento do zebrafish, variando de imagens ao vivo de moléculas marcou a immunolabeling de fixa tecido11,12,13,14. Embora MTs em uma única célula podem existir nos Estados dinâmicos ou estáveis, epitelização é um processo no qual o MTs são estabilizadas progressivamente ao longo do tempo. Usando marcadore…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O microscópio confocal foi comprado com fundos de o US National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. A pesquisa foi apoiada por os E.U. institutos de saúde nacional/Instituto Nacional de General Medical Ciências (NIH/NIGMS) concessão #GM085290 e E.U. departamento de defesa (DOD) grant #W81XWH-16-1-0466 atribuído a R.M. Brewster. E. Vital foi apoiada por uma concessão a UMBC do Howard Hughes Medical Institute, através da pre-faculdade e programa de educação científica de graduação, conceder #52008090. S.P. Brown foi apoiado por um departamento E.U. de educação GAANN Fellowship, uma bolsa de pós-graduação Meyerhoff financiado pela concessão de NIH/NIGMS, #GM055036 e um trabalho de assistente de investigação financiado pelos E.U. DOD grant #W81XWH-16-1-0466.

Materials

Low Melting Point Agarose IBI scientific IB70050 Only used for embedding.

Prepare 4% LMP agarose
by heating a solution of  4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave
until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured
Agarose Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose
by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave
until polymerized. 
Nocodazole Sigma 487928-10MG Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots.  Store at -20 ˚C.
8% Formaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8-100 Aliquot and store at -20 ˚C.
Kpipes Sigma P7643
NaCl Sigma S7653
Tris-HCl Sigma T3253-500G
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2·2H2O Sigma C5080
NP-40 American Bioanalyticals AB01424
EGTA Sigma E3889-25G
MgCl2 Sigma M2670-500G
Normal Goat Serum Millipore S26-100ml Aliquot and store at -20 ˚C.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605
Triton-x American Bioanalyticals AB02025
Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) Sigma P5147-1G make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C.
Anti-Fade mounting medium Invitrogen P10144
DAPI Invitrogen D1306 Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock  with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months.
Mouse anti-β-tubulin Developmental studies Hybridoma Bank E7 1/200
Rabbit anti-γ-tubulin Genetex GTX113286 1/500
Rabbit anti-α-tubulin Genetex GTX108784 1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin Millipore AB3201 1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin Millipore ABT171 1/500
Mouse anti-centrin Millipore 04-1624 1/1000
Goat 488 anti-rabbit Thermofisher A11008 1/500
Goat 594 anti-rabbit Thermofisher A11012 1/500
Goat 594 anti-mouse Thermofisher A11005 1/500
Goat 488 anti-mouse Thermofisher A11001 1/500
Vibratome Vibratome 1500
Forceps World Precision Instruments 555227F
100 mm petri dish Cell treat 229693
35 mm petri dish Cell treat 229638
50 ml falcon tube Fisher 14-432-22
Woven nylon mesh 70 um Amazon.com B0043D1SZG 
Micropipette Gilson F123602
Glass pipette Fisher NC-999363-9
Aquarium sealant Amazon.com, by MarineLand Silicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring stand Fisher 14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID Cole-Parmer WU-06417-21
Modeling clay Amazon.com Sargent Art 22-4000 Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp Fisher 02-215-466
60ml syringe Fisher 14-820-11
Embryo medium (E3) 34.8 g NaCl
1.6 g KCl
5.8 g CaCl2·2H2O
9.78 g MgCl2·6H2O

To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. 
Blocking Solution 50 ml TBS-NP-40
2.5 ml normal goat serum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6) 155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4) 160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software PerkinElmer Volocity (V 6.2)
Dry block heater  VWR 12621-108 Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope Leica MZ12
Confocal Microscope Leica SP5
Flat embedding mold emsdiasum.com BEEM 70904-01
Public domain image processing software NIH ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number

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McFarland, R. J., Brown, S. P., Vital, E., Werner, J. M., Brewster, R. M. Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (127), e55792, doi:10.3791/55792 (2017).

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