Summary

Verwendung von Immunolabeling, stabilen, dynamischen und im Entstehen begriffene Mikrotubuli in Zebrafish Embryos zu analysieren

Published: September 20, 2017
doi:

Summary

Immunolabeling Methoden für die unterschiedliche Populationen von Mikrotubuli in das sich entwickelnde Gehirn Zebrafisch Analyse werden hier beschrieben, die sind breit anwendbar auf andere Gewebe. Das erste Protokoll beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling stabile und dynamische Mikrotubuli. Das zweite Protokoll stellt eine Methode zum Bild und speziell im Entstehen begriffenen Mikrotubuli zu quantifizieren.

Abstract

Mikrotubuli (MTs) sind dynamisch und fragile Strukturen, die schwierig zu Bild in Vivo, insbesondere in vertebrate Embryonen sind. Immunolabeling Methoden werden hier beschrieben, um verschiedene Populationen von MTs in den Entwicklungsländern Neuralrohr des Zebrafish Embryos zu analysieren. Während der Fokus auf Nervengewebe befindet, ist diese Methodik breit anwendbar auf andere Gewebe. Die Verfahren sind für früh zur Mitte-Somitogenesis-Embryonen (1 Somiten zu 12 Somiten), aber sie zu einer Reihe von anderen Stufen mit relativ geringfügigen Anpassungen sind optimiert. Das erste Protokoll stellt eine Methode zur Bewertung der räumlichen Verteilung der stabile und dynamische MTs und eine Quantitative Analyse dieser Populationen mit Bildverarbeitungs-Software. Dieser Ansatz ergänzt vorhandene Tools Bild Mikrotubuli Dynamik und Verteilung in Echtzeit, mit transgenen Linien oder transiente Expression tagged Konstrukte. Solche Werkzeuge sind in der Tat sehr nützlich, aber sie nicht ohne weiteres zwischen dynamischen und stabilen MTs unterscheiden. Die Möglichkeit, Bild und analysieren diese ausgeprägte Mikrotubuli Populationen hat wichtige Implikationen für Verständnis Mechanismen Zelle Polarisation und Morphogenese. Das zweite Protokoll beschreibt eine Technik, um im Entstehen begriffene MTs gezielt zu analysieren. Dies wird erreicht durch die Erfassung der de Novo Wachstumseigenschaften der MTs im Laufe der Zeit nach Mikrotubuli Depolymerisation mit dem Medikament Nocodazole und eine Erholungsphase nach Medikament auswaschen. Diese Technik noch nicht auf das Studium der MTs in den Zebrafish Embryos angewendet, sondern ist ein wertvoller Test zur Untersuchung der in Vivo -Funktion von Proteinen in die Mikrotubuli Montage verwickelt.

Introduction

Mikrotubuli (MTs) sind Polymere von α und β-Tubulin, die in linearen Protofilaments zusammenbauen, von denen mehrere kombinieren, um eine hohle Röhre1,2bilden. MTs sind polarisierte Strukturen, mit schnell wachsenden plus enden und minus enden, die an die Centrosome oder andere Mikrotubuli-organizing Center (MTOC)3verankert sind langsamwüchsig. De novo MT-Bildung wird durch Keimbildung bei der γ-Tubulin-Ring-Komplex (γ-TURC), bietet eine Vorlage für MT Montage4eingeleitet. In einer bestimmten Zelle können zwei Populationen von MTs, die wiederum über unterschiedlich unterschieden werden. Dynamische MTs erforschen ihre zelluläre Umgebung durch den Wechsel zwischen Phasen von Wachstum und Schrumpfung in einem Prozeß bekannt als dynamische Instabilität5. Im Gegensatz zu dynamischen MTs stabile MTs nicht wachsen und haben eine längere Halbwertszeit als dynamische MTs6.

Jahrzehntelanger Forschung in Zellbiologie hat eine anspruchsvolle Reihe von Tools zur Untersuchung MT Struktur und Funktion zur Verfügung gestellt und führte zu einen großen Körper des Wissens über diese Zellskelett Elemente. Zum Beispiel MTs spielen eine zentrale Rolle bei der Einrichtung und Wartung der Zellpolarität, die nicht nur auf ihre innere Polarität, sondern auch für die differenzielle subzelluläre Verteilung der Stall im Vergleich zu dynamischen MTs7, ist 8. dagegen weit weniger versteht sich über MT Architektur und Funktion in komplexere dreidimensionale (3D) Umgebungen, z. B. vertebrate Embryos, teilweise wegen der Herausforderung von imaging-MT Zytoskeletts mit hoher Auflösung. Trotz dieser Einschränkung die jüngsten Generation der GFP exprimierenden transgene Linien dieses Label MTs oder transiente Expression fluoreszent markiert MT Marker erhöht hat unser Verständnis von der dynamischen Veränderungen, die MTs zu unterziehen und ihre zellulären und Rolle des Zebrafish Embryos. Das Gesamtnetz der MT kann abgebildet in transgenen Linien in die Tubulin ist entweder direkt beschriftet9 oder Tubulin Polymere mit MT-assoziierte Proteine indirekt gekennzeichnet sind Doublecortin-Like-Kinase (Dclk) oder Ensconsin (EMTB)10, 11. Andere Linien (und Konstrukte) erzeugt wurden, die Bewertung der MT innere Polarität durch gezielt beschriften MT plus enden aktivieren oder Centrosome verankert minus enden11,12,13, 14. die Macht dieser Werkzeuge liegt in der Fähigkeit, MT Dynamik im Leben, zu studieren Organismen zu entwickeln. Solche Studien haben gezeigt, zum Beispiel die räumliche und dynamische Verteilung der MTs in bestimmten Zellpopulationen, die Ausrichtung der mitotischen Spindeln im Gewebe Morphogenese (ein Indikator für die Ebene der Zellteilung), durchläuft die Polarität des MT-Polymers Bezug auf Prozesse wie Zelle Dehnung und Migration, und MT Wachstumsrate von Komet Geschwindigkeit9,13,15bestimmt. Die Begrenzung dieser Werkzeuge ist, dass sie nicht ohne weiteres zwischen stabiler und dynamischer MT Bevölkerungsgruppen diskriminieren.

Zeichnung aus der reichen Zelle Biologie Literatur, werden Immunolabeling Methoden, um stabile und dynamische MTs des Zebrafish Embryos Bild hier beschrieben, sind die Verwendung von transgenen Linien ergänzen. Der weit verbreiteten Einsatz solcher Immunolabeling Methoden in der Zebrabärbling wurde durch die Schwierigkeit MT Integrität zu bewahren, während des Verfahrens Fixierung etwas behindert. Protokoll Nr. 1 beschreibt eine optimierte Methode für Immunolabeling insgesamt, dynamisch, und stabile MTs in Querschnitte der entwickelnden Zebrafisches Hinterhirn. Darüber hinaus ist eine einfache Methode, die Verwendung von kommerziell verfügbaren Software beschrieben, um diese MT-Populationen zu quantifizieren. Stabile MTs unterscheiden sich von dynamischen MTs basierend auf mehrere post-translationalen Modifikationen von α-Tubulin, wie Acetylierung und Detyrosination, die auf stabile MTs über Zeit16,17ansammeln. Im Zebrafish Embryos tritt Acetylierung auf ciliary und axonalen MTs aber nicht auf stabile Interphase MTs18, die Nützlichkeit dieses Markers auf eine Teilmenge der stabilisierten MTs zu begrenzen. Im Gegensatz dazu scheint Detyrosination auf allen stabilen MTs im Zebrafish Embryos18auftreten. Diese Post-translationale Modifikation stellt die Carboxy-Terminal Glutaminsäure α-Tubulin (Detyrosinated Tubulin)18 und mit Anti-Glu-Tubulin19detektiert werden. Obwohl Detyrosination bevorzugt auf stabile MTs auftritt, zeigt experimentelle Beweise, dass dieser Post-translationale Modifikation zurückzuführen, sondern als eine Ursache für MT Stabilität16. Die gegenseitige MT Bevölkerung, bestehend aus dynamischen MTs zeichnet sich mit einem Antikörper, anti-Tyr-Tubulin, erkennt, dass speziell die Tyrosinated Form von α-Tubulin19. Nach Immunolabeling mit diesen Markern und konfokale Bildgebung kann die Quantitative Analyse von MTs (Länge, Anzahl und relative Häufigkeit) in definierten Regionen des entwickelnden Neuralrohrs durchgeführt werden. Eine optimierte Methode ist hier für die Durchführung dieser Analyse mit 3-d-Bildverarbeitung Software zur Verfügung gestellt. Diese Methode kann auf Fragen bezüglich Morphogenese und der Einrichtung oder Reifung der Zelle Polarität20angewendet werden. In der Tat, die Ausarbeitung von polarisierten Arrays von stabilen MTs begleitet viele entwicklungspolitische Veranstaltungen, darunter Photorezeptor Morphogenese21, Epithelisierung von Zellen in den Entwicklungsländern Neuralrohr18 und Axon Bildung8.

Protokoll Nr. 2 beschreibt eine in-Vivo -Adaption eines Zelle Biologie Assays MTs Analyse während ihrer Versammlung Phase (Keimbildung/Anchorage und Wachstum)22,23. Im Entstehen begriffenen MTs sind kernhaltige an die Centrosome und anschließend an subdistal Anhängsel der Mutter Zentriol23verankert. Eine Methode, um entstehende MT nachwachsen nach Depolymerisation analysieren wird beschrieben. Dieses Protokoll enthält Informationen über die Nocodazole Behandlung, MTs, das Medikament Auswaschung Verfahren und der Nachbehandlung Erholungsphase depolymerisieren. MT nachwachsen wird in regelmäßigen Abständen überwacht.s Post Auswaschung von Immunolabeling mit Markierungen für insgesamt MTs (anti-β-Tubulin) neben Marker für die Centrosome (anti-γ-Tubulin) und Kern (4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)), nach den allgemeinen Verfahren, die im Protokoll Nr. 1beschrieben. Der MT Depolymerisation Schritt dieses Protokolls ist wichtig, da es ermöglicht die Beurteilung der de Novo MT Wachstum als Erweiterung der bereits vorhandenen MTs. Diese Technik unterscheidet sich somit von anderen veröffentlichten Verfahren, MT Wachstumsraten (in Abwesenheit der Depolymerisation) zu messen, durch die Verwendung einer plus Spitze Markers wie Ende bindende Protein 3 verschmolzen zu grün fluoreszierendes Protein (EB3-GFP), wie im Tran Et Al.gezeigt, 2012-11. Darüber hinaus dieser Assay eignet sich besonders für die Analyse von Embryonen in de Novo MT Baugruppe defekt wie die zuvor gemeldeten NEDD1 Mutanten in der Rekrutierung von γ-Tubulin, das Centrosome beeinträchtigt ist, was zu unvollständig Bildung des Neuralrohrs und neuronale Defekte24.

Protocol

Ethik-Anweisung: die Verfahren beschrieben folgen der University of Maryland Baltimore County Tierbetreuung Leitlinien. 1. Analyse des stabilen und dynamische MTs verwenden Immunolabeling (Protokoll 1) manuelle Dechorionation von Embryonen vor der Fixierung erhalten frisch Embryonen von überschüssigem Wasser gießt hervorgebracht und dann sammeln überzählige Embryonen in einem Kunststoff Petrischale (siehe Tabelle der Werkstoffe). …

Representative Results

Analyse der stabile und dynamische MTs mit immunolabelingIn Protokoll Nr. 1ist die Verteilung der MT Sub-Populationen während der frühen (neuronale Kiel) und späten Neuralrohr (neuronale Stab) Entwicklungsstadien offenbart, mit Glu-Tubulin und Tyr-Tubulin als Marker für stabile und dynamische MTs, beziehungsweise. Dynamische MTs überwiegen in dem Hinterhirn Stadium der neuronalen Kiel (4-5 Somiten) (Abbildung 2<stron…

Discussion

Derzeit gibt es viele Methoden für imaging-MT-Dynamik in der frühen Entwicklung der Zebrafisch, von live Imaging tagged Moleküle bis hin zu Immunolabeling der Gewebe11,12,13,14behoben. MTs in einer einzelnen Zelle in dynamischen oder stabile Staaten existieren können, zwar Epithelisierung ein Prozess in dem MTs schrittweise im Laufe der Zeit stabilisiert werden. Mit Hilfe von Markern für s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Das konfokale Mikroskop wurde mit Mitteln von US National Science Foundation (NSF), Grant #DBI-0722569 gekauft. Die Forschung wurde durch die US nationale Institute der Gesundheit/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) Grant #GM085290 und US-Department of Defense (DOD) Grant #W81XWH-16-1-0466 verliehen an r.m. Brewster unterstützt. E. Vital wurde unterstützt durch einen Zuschuss zu UMBC vom Howard Hughes Medical Institute durch die Pre-College und Undergraduate Science Education Program, #52008090 zu gewähren. S.p. Brown wurde unterstützt durch eine US of Education GAANN Fellowship, ein Meyerhoff Graduate Fellowship von NIH/NIGMS Grant #GM055036 und eine Forschung Assistentenstelle finanziert durch die US DOD Grant #W81XWH-16-1-0466 finanziert.

Materials

Low Melting Point Agarose IBI scientific IB70050 Only used for embedding.

Prepare 4% LMP agarose
by heating a solution of  4 grams LMP agarose per 100 ml 1X TBS in a microwave
until polymerized. Keep warm on a 50 ˚C hot plate with the cap secured
Agarose Used to treat petridishes.   Prepare 1% agarose
by heating a solution of  1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave
until polymerized. 
Nocodazole Sigma 487928-10MG Make stock by dissolving entire bottle of powder in distilled water and aliquoting into 500ul aliquots.  Store at -20 ˚C.
8% Formaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8-100 Aliquot and store at -20 ˚C.
Kpipes Sigma P7643
NaCl Sigma S7653
Tris-HCl Sigma T3253-500G
KCl Sigma P9333-500G
CaCl2·2H2O Sigma C5080
NP-40 American Bioanalyticals AB01424
EGTA Sigma E3889-25G
MgCl2 Sigma M2670-500G
Normal Goat Serum Millipore S26-100ml Aliquot and store at -20 ˚C.
Bovine serum albumin (BSA) Fisher BP1605
Triton-x American Bioanalyticals AB02025
Pronase E (non-specific Protease from Streptomyces griseus) Sigma P5147-1G make stock solution by diluting 10mg per ml of ddH2O. Aliquot in 1ml aliquots and store at -20 ˚C.
Anti-Fade mounting medium Invitrogen P10144
DAPI Invitrogen D1306 Prepare 50 ml DAPI solution by first combining 1 µl DAPI stock  with 1 ml sterile water and then adding the DAPI/water mix to 49 ml 1X TBS; store in foil at 4 ˚C for months.
Mouse anti-β-tubulin Developmental studies Hybridoma Bank E7 1/200
Rabbit anti-γ-tubulin Genetex GTX113286 1/500
Rabbit anti-α-tubulin Genetex GTX108784 1/1000*
Rabbit anti-detyrosinated-tubulin Millipore AB3201 1/200-1/1000*  Titrate antibody with first use of new lot.
Rabbit anti-tyrosinated-tubulin Millipore ABT171 1/500
Mouse anti-centrin Millipore 04-1624 1/1000
Goat 488 anti-rabbit Thermofisher A11008 1/500
Goat 594 anti-rabbit Thermofisher A11012 1/500
Goat 594 anti-mouse Thermofisher A11005 1/500
Goat 488 anti-mouse Thermofisher A11001 1/500
Vibratome Vibratome 1500
Forceps World Precision Instruments 555227F
100 mm petri dish Cell treat 229693
35 mm petri dish Cell treat 229638
50 ml falcon tube Fisher 14-432-22
Woven nylon mesh 70 um Amazon.com B0043D1SZG 
Micropipette Gilson F123602
Glass pipette Fisher NC-999363-9
Aquarium sealant Amazon.com, by MarineLand Silicone Sealer 1 oz (Tube) 
Ring stand Fisher 14-675BO
Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID Cole-Parmer WU-06417-21
Modeling clay Amazon.com Sargent Art 22-4000 Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice
Clamp Fisher 02-215-466
60ml syringe Fisher 14-820-11
Embryo medium (E3) 34.8 g NaCl
1.6 g KCl
5.8 g CaCl2·2H2O
9.78 g MgCl2·6H2O

To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L. 
Blocking Solution 50 ml TBS-NP-40
2.5 ml normal goat serum
1 g BSA
625 µl Triton-X
TBS-NP-40 (pH 7.6) 155 mM NaCl
10 mM Tris HCl
0.1% NP-40
2x MAB (pH6.4) 160 mM KPIPES
10 mM EGTA
2 mM MgCl2
Commercial 3-D Image processing Software PerkinElmer Volocity (V 6.2)
Dry block heater  VWR 12621-108 Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.
Dissecting Microscope Leica MZ12
Confocal Microscope Leica SP5
Flat embedding mold emsdiasum.com BEEM 70904-01
Public domain image processing software NIH ImageJ (V 1.5)
* Success varies by lot number

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McFarland, R. J., Brown, S. P., Vital, E., Werner, J. M., Brewster, R. M. Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (127), e55792, doi:10.3791/55792 (2017).

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