Aquí describimos la entrega de microRNA usando un serotipo de virus adeno-asociado recombinante 9 en un modelo de ratón de una enfermedad neuromuscular. Una sola administración periférica en ratones dio lugar a la sobreexpresión de miRNA sostenida en el músculo y neuronas del motor, proporcionando una oportunidad de estudio miRNA función y potencial terapéutico en vivo.
ARN de interferencia vía el camino de los miRNA endógenos regula la expresión génica mediante el control de la síntesis de proteínas a través del silenciamiento génico postranscripcional. En los últimos años, la regulación génica mediada por miRNA ha demostrado potencial para el tratamiento de los trastornos neurológicos causados por un aumento tóxico del mecanismo de la función. Sin embargo, entrega eficiente a los tejidos Diana ha limitado su aplicación. Aquí hemos utilizado un modelo de ratón transgénico para la atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA), una enfermedad neuromuscular causada por la extensión del polyglutamine en el receptor de andrógenos (AR), para probar el silenciamiento génico por una nueva miRNA AR metas identificada, miR-298. Sobreexpresa miR-298 usando un vector de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) serotipo 9 para facilitar la transducción de las células no se dividen. Una sola inyección de la vena de la cola en ratones SBMA inducida por la sobreexpresión sostenida y generalizada de miR-298 en músculo esquelético y neuronas motoras y dio lugar al mejoramiento del fenotipo neuromuscular en los ratones.
MiRNAs son no-codificación RNAs, 21-23 nucleótidos de longitud, que juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica y control de diversas vías metabólicas y celulares. 1 expresión génica está regulada principalmente por inducir degradación de silenciamiento o ARNm postranscripcional del gen. 2 MiRNAs son generalmente complementarios a la región 3′ no traducida (UTR) de codificación de genes, aunque vinculante a los 5′ UTR y regiones de la meta que ARNm también se ha descrito la codificación. 3
Como se expande la comprensión actual de los papeles de miRNA en la patogenia de enfermedades humanas, modulación farmacológica de miRNAs individuales o familiares de miRNA se está convirtiendo en una opción terapéutica viable. En comparación con otras estrategias de inhibición de la RNA, miRNAs tienen muchas ventajas: miRNAs son menos tóxicos y menos inmunogénica y puede entregar fácilmente en las células debido a su pequeño tamaño. 4 , 5 , 6 MiRNAs tienen varios objetivos dentro de las redes celulares, por lo tanto posibles efectos off-target y preocupaciones de seguridad deben tomarse en cuenta, junto con una entrega eficaz a los tejidos diana.
Enfermedades neuromusculares se adquieren o heredan las condiciones que afectan los músculos y las neuronas motoras. La segmentación de las drogas al músculo esquelético, es un área emergente de investigación, donde el principal desafío es lograr amplia distribución dentro de la ventana terapéutica. 7 las neuronas motoras son más difíciles de dirigir, principalmente porque el acceso de drogas está impedido por la barrera hematoencefálica.
Se utilizaron modelos de ratón y cultura de célula de atrofia muscular espinal y bulbar (SBMA) en este estudio. SBMA es una enfermedad neuromuscular provocada por un aumento tóxico del mecanismo de la función, en la que se ven afectadas músculos y las neuronas motoras. 8 , 9 SBMA (enfermedad de Kennedy; OMIM #313200) es X-ligado enfermedad, caracterizada por debilidad muscular y atrofia, causada por la extensión de la repetición CAG en el gene de AR, que codifica una zona ampliada del polyglutamine en la proteína de la AR . 10 ningún tratamiento modificador de la enfermedad es actualmente disponible para este desorden. El modelo de ratón transgénico utilizado en este estudio recoge las características de la enfermedad, incluyendo la especificidad de género, patología de la neurona motora y atrofia muscular progresiva. 11
En este estudio, nuestros esfuerzos se centraron en la identificación de un miRNA que directamente regula expresión del transgen mutante de AR y en el diseño de un modo seguro y eficiente de entrega de lo miRNA en la médula espinal y el músculo esquelético de nuestro modelo de ratón de la enfermedad.
Aquí identificamos un miRNA relativamente no caracterizado, miRNA-298 (número MIMAT0004901),12 para reducir directamente expresión de AR mutante en modelos SBMA. Para lograr la entrega de miR-298 a los tejidos diana, utilizamos una estrategia viral, virus adeno-asociado recombinante del serotipo 9 (rAAV9). rAAV9 es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y mediando a largo plazo expresión génica en las células no se dividen, incluyendo las neuronas. 13 una sola administración sistémica de AAV9-miR-298 dio lugar a la expresión sostenida de la miRNA, transduction eficiente de los músculos y las neuronas motoras, abajo-regulación de la expresión de AR y mejorar el fenotipo de la enfermedad en ratones SBMA. 14 esta metodología puede utilizarse para proporcionar miRNA o antagomirs sobreexpresión en vivo.
Aquí demostramos una metodología altamente eficiente y accesible para seleccionar y entregar mediante inyección de cola un miRNA usando rAAV9 como un vector viral, músculo esquelético y neuronas del motor en ratones. 14 en comparación con otras estrategias de ARNi, miRNAs son menos inmunógenas y menos tóxicas. 18 además, su pequeño tamaño hacen bien adaptado a la capacidad de embalaje limitada de vectores virales. 2 algoritmos computacionales y herramientas de predicción permiten la identificación de objetivos supuestos miRNA-mRNA. Una vez identificados, deben verificarse los efectos del miRNA en la expresión del gen objetivo. Un enfoque común es sobreexpresar un miRNA dado en vitro y detectar niveles de expresión de proteína objetivo usando análisis occidental. 14 , 19
Varios estudios han utilizado estrategias virales y no virales para la entrega de miRNAs. 13 aquí se utilizó virus adeno-asociado (AAV) como una herramienta de entrega de genes. En comparación con otros vectores virales, AAV provoca baja inmunogenicidad, permite la transferencia de genes a largo plazo, y tiene un amplio espectro de tropismo en la división y las células no se dividen. 18 este método también puede evitar la necesidad de modificación química que puede afectar la funcionalidad y especificidad de la molécula de RNA. Existen varios serotipos de AAV, que en su mayoría están determinados por la composición de las proteínas de la cápside. Estos serotipos difieren en su tropismo y transducen diferentes tipos de células. Es necesario seleccionar el serotipo correcto al considerar el tejido diana. Seleccionamos rAAV9, debido a su eficiencia de transducción alta en el sistema nervioso central y músculo esquelético después de administración periférica19,20. Este enfoque ha demostrado una mayor eficacia de transducción de señales en animales neonatales en comparación con animales adultos, probablemente debido a diferencias en la composición de la matriz extracelular, proporción neurona-glia y madurez de la barrera hemato-encefálica. 21 , 22
Un paso importante en este protocolo es el diseño del vector de expresión. En comparación con los vectores bicistronic, que se ven obstaculizados por la menor expresión del gen segundo en comparación con el primer gen junto a la promotora, el vector dual promotor permite una configuración consecutivas produciendo alta expresión de los miRNA y EGFP, así permitiendo la localización de lo miRNA en tejidos de ratón por inmunofluorescencia.
La inyección intravenosa de AAV9 resultó en alta eficiencia y transducción homogéneo en los tejidos diana, músculo esquelético y neuronas motoras. Esta ruta de inyección permite que la dosis administrada alcanza la circulación sistémica y cruzar la barrera de sangre del cerebro, que es importante para las terapias dirigidas al sistema nervioso central. Además, es un método no invasivo para la entrega al SNC. MiR-298 expresión aumentada de la médula espinal y el músculo después de 2-4 semanas con una sola inyección periférica en 5 semanas de edad. Cuando usando vectores AAV de genoma monocatenario, la síntesis de novo de la segunda hebra de ADN puede explicar la transducción retrasada. 23
Niveles de humano miR-298 eran imperceptibles en ratones tratados 20 semanas después de una administración única, lo que sugiere que las enfermedades crónicas, múltiples inyecciones puede requeridas para alcanzar un beneficio terapéutico. Sin embargo, miRNA degradación con el tiempo puede ser limitante cuando se requiere una administración repetida de por vida. Además, inmunidad adaptativa a vectores AAV puede formar otra barrera para una entrega exitosa gene. 24 así generación de vectores AAV que son inmunológicamente inertes es crucial para la administración repetida y lograr efectos a largo plazo con este prometedor sistema de entrega. 25
Una limitación en el uso de miRNA como una estrategia terapéutica es el riesgo de efectos off-target. MiRNAs pueden interactuar a través de incomplementary base que se aparea con otras transcripciones del gene, que representa un riesgo de seguridad con este enfoque. Mejorado el diseño de las secuencias de RNAi, incluyendo uso de miRNAs no canónico, como mirtrons, que eludir el complejo microprocesador y amplios estudios de seguridad y tolerabilidad a largo plazo son esenciales antes de traducir esta estrategia en una caja de seguridad y terapia eficaz. 26 , 27 , 28
El método descrito aquí fue desarrollado originalmente para la sobreexpresión de miRNA, pero también puede ser utilizada para terapia de inhibición de miRNA usando antagomirs.
The authors have nothing to disclose.
Los autores no declaran conflicto de intereses. Agradecemos a laboratorios SignaGen (Rockvile, MD, USA) para la producción de virus AAV9. Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramuros del NINDS, NIH. Philip R. Lee fue apoyado por fondos de la división de investigación intramuros de NICHD. Carlo Rinaldi fue apoyado por una beca de la Association Française contre les Myopathies (AFM).
QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Lysis of fatty and standard tissues before RNA isolation |
miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | Purification of miRNA and total RNA |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit | ThermoFisher Scientific | 4366596 | A highly specific kit that quantitates only mature miRNAs |
snoRNA202 Primer | ThermoFisher Scientific | 1232 | Taqman miRNA control assay in mouse |
miR-298 Primer | ThermoFisher Scientific | 2190 | Taqman miRNA-298 assay in mouse |
Anti-GFP antibody | abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP – ChIP Grade |
Red ink pad | Dovecraft Essentials | ||
Blue ink pad | Dovecraft Essentials | ||
AAV9-GFP vector | SignaGen Laboratories | SL100840 | Large scale AAV plasmid construction, packaging and purification |
mmu-miR-298-5p | ThermoFisher Scientific | MC12525 | mirVana miRNA mimic |
AAV9-EF1a-has-mir-298-GFP | Vector Biosystems Inc |